Sinalizador celular – Ubiquitina

Sinalizador celular – Ubiquitina

Ubiquitina

A ubiquitina é uma proteína fundamental na regulação de processos biológicos, assinalando algum processo que deve acontecer ao substracto com o qual está ligado, como por exemplo as proteínas alvo serem degradadas pelo proteossoma.

O proteossoma é uma proteína com função de degradação de outros substractos, como um triturador que as células possuem.

http://youtu.be/93in7Bxo5W0

Cerca de 600 genes codificam ubiquitina-ligases no genoma humano. Foi descrita uma ubiquitina-ligase que controla a dinâmica mitocondrial, denominada MULAN ( Mitochondrial Ubiquitin Ligase Activation of NF-kB ).

O gene BRAC1, ligado ao cancro da mama e outros cancros, como pâncreas e próstata, quando mutado pode eliminar a função ubiquitina-ligase.

cDNA ou DNA complementar é o DNA sintetizado por uma molécula de RNA mensageiro numa reacção catalizada pela transcriptase reversa que quando inserido numa célula, este cDNA pode levar ao aumento dos níveis da proteína codificada.

RNAi ou RNA de interferência é uma técnica que permite inibir a acção dum gene escolhido, por exemplo o RNAi pode suprimir genes que causam tumores diminuido o desenvolvimento do cancro.

http://www.youtube.com/watch?v=93in7Bxo5W0

A via da ubiquitinação tem 3 etapas, sendo que cada uma envolve uma enzima: E1 ( enzima activadora da ubiquitina ), E2 ( enzima conjugadora ) e E3 ( ubiquitina-ligase ).

Via ubiquitina-proteossoma

A via da ubiquitina-proteossoma é uma via proteolítica que, ao contrário das demais, consome ATP e inicia-se com a ubiquitinação da proteína alvo.

Os alvos da ubiquitina são:

• receptores celulares da membrana celular
• moduladores de crescimento e supressores de tumor
• activadores e inibidores de transcripção
• reguladores de ciclo celular
• proteínas mutantes ou danificadas, sendo estas especialmente frequentes chegando a 30% das proteínas recém-sintetizadas

http://youtu.be/4DMqnfrzpKg

As chaperonas desempenham um papel activo no reconhecimento das proteínas com síntese defeituosa. As chaperonas são proteínas que auxiliam outras proteínas a se dobrarem, necessitando várias chaperonas de ATP, e algumas proteínas para atingirem a estrutura quaternária são dependentes das chaperonas. O reconhecimento da má dobragem das proteínas, ainda que não totalmente ilucidado, sabe-se que utiliza os grupos hidrofóbicos para esse reconhecimento.

As chaperonas interferem activamente na ubiquitinação, interagindo com as enzimas E2, pensando-se que as chaperonas são responsáveis pelo reconhecimento e marcação da proteína pela ubiquitina.

http://www.youtube.com/watch?v=SUCgAxI8rhg

Outro sistema importante para o reconhecimento de proteínas mal formadas é o ERAD ( Endoplasmic Reticulum Associated protein Degradation ) que é o responsável pela degradação das proteínas sintetizadas no retículo endoplasmático e que também utiliza as chaperonas como auxiliares. Estas proteínas após a ubiquitinação vão para o citoplasma e são degradadas pelos proteossomas.

A via ubiquitina-proteossoma envolve várias etapas, nomeadamente:

1. Activação: a enzima E1 activa a ubiquitina cujo resíduo C-terminal se liga covalentemente a um resíduo sulfidril-cisteína da E1 na presença de Mg²+ e com consumo de uma molécula de ATP que se degrada em AMP e Pi ( pirofosfato )
2. Transferência: a ubiquitina é transferida para a enzima E2 e liberta-se a enzima E1
3. Reconhecimento: a enzima E3 reconhece e liga-se à proteína alvo formando um complexo não covalente
4. Ubiquitinação: o complexo E2-ubiquitina liga-se a E3 por forma à ubiquitina ser transferida de E2 para o grupo amina dum resíduo lisina da proteína alvo
5. Libertação: a enzima E3 solta-se, libertando E2 e a proteína ubiquitinada
6. Poli-ubiquitinação: as etapas 3, 4 e 5 repetem-se formando uma ou mais cadeias de ubiquitina, cadeias estas que se ligam aos resíduos de lisina da última cadeia
7. Desubiquitinação: a cadeia de ubiquitina é reconhecida pelo proteossoma, sendo a proteína desubiquitinizada por enzimas próprias e a proteína desdobrada com consumo de ATP e hidrolisada, dando origem a pequenos peptídeos de 7-9 aminoácidos.

Apenas proteínas que sofreram poli-ubiquitinação são capazes de acessar ao núcleo proteolítico do proteossoma.

A enzima E3 ( ligase ) é a responsável pela especificidade da ubiquitinação capaz de fazer o reconhecimento e etiquetagem de vários substractos.

A ubiquitinação é um processo reversível em que as desubiquitinases ( enzimas hidrolíticas ) competem com o proteossoma, removendo as ubiquitinas terminais da cadeia ou mesmo a cadeia inteira.

Ao contrário da ubiquitinação, que é um processo reversível, a proteólise não o é, uma vez que as proteínas são degradadas a oligopeptídeos. Esta assimetria reaccional permite impôr uma direcção ao sistema, permitindo por exemplo o ciclo celular.

Via da ubiquitina-proteossoma ( UPP )

A ubiquitina é uma proteína das células eucarióticas, formada por 76 aminoácidos, e que tem uma função importante na regulação da síntese proteica, marcando as proteínas mal dobradas para estas serem degradadas pelos proteossomas.

A ubiquitina, para além do processo proteolítico não lisossomal, das proteínas mal dobradas, também tem acção não proteolítica no transporte pela membrana, na estrutura e transcripção da cromatina, na reparação do DNA e noutras vias sinalizadoras.

http://www.youtube.com/watch?v=4DMqnfrzpKg

As proteínas encontram-se num estado dinâmico, sendo continuamente sintetizadas e degradadas, sendo o controlo dessa actividade e degradação vital para a célula. As vias proteolíticas são os meios pelos quais as células se libertam das proteínas indesejadas.

As principais vias proteolíticas são a via lisossomal, via dependente do cálcio e via da ubiquitina-proteossoma, sendo que esta última difere das anteriores por ser selectiva e consumir ATP.

A ubiquitina é uma molécula que tanto se encontra no núcleo como no citoplasma; apresenta grande tolerância ao pH e à temperatura, apenas variando entre a conformação dobrada e não dobrada, justificada esta conformação por ser determinada por ligações de hidrogéneo.

A estrutura secundária da ubiquitina é formada por 3 segmentos em α-hélice e 5 em folhas β, tendo um peso molecular de 8564 Daltons

Estrutura tridimensional da ubiquitina

Ubiquitinas podem formar cadeias através da ligação de várias ubiquitinas, ocorrendo a ligação entre a glicina terminal e a lisina, podendo esta ligação ser feita várias vezes, originando di-, tri- ou tetra-ubiquitinas. A síntese da ubiquitina realiza-se nos ribossomas.

Tanto a ubiquitina como sua via proteolítica participam de diversos processos celulares. A ubiquitina liga-se à ciclina, na fase G1 da mitose, ajudando a regular o ciclo celular; a ubiquitina é responsável por estimular a diferenciação entre os tipos de linfócitos B e T, e seus fragmentos funcionam extracelularmente como imunossupressores. A ubiquitina tem acção na biogénese dos ribossomas, modulação de receptores celulares, expressão génica, reparação de DNA, resposta ao stress, morfogénese neuronal, memória de longo prazo, ritmos circadianos e em diversas doenças como Alzheimer, Down, cancro, HIV e Ébola.

A ubiquitinação realiza-se com a ajuda de 3 tipos de enzimas: E1, E2 e E3. Só é conhecida uma E1 ( enzima activadora da ubiquitina ) que transfere ubiquitina a todas as E2, sendo que a E2 já tem alguma especificidade ao substracto, embora sejam as E3 as que apresentam grande especificidade. Enquanto há apenas uma E1, existem 5-12 proteínas E2. As E3, de 250 kDa, são as responsáveis pelo reconhecimento da proteína e transferência da ubiquitina de E2 para E3. Actualmente aceita-se que a poli-ubiquitinação é mediada pela enzima E4, que coopera com as E3 para estabelecer a cadeia de poli-ubiquitina.

Todas as proteinas intracelulares e muitas extracelulares estão constantemente a ser reconstituídas, isto é são hidrolizadas nos seus aminoácidos constituintes e novamente sintetizadas. Esta situação de construção-destruição das proteínas é importante para funções homeostáticas. A degradação das proteínas não é feita para todas à mesma velocidade, indo o tempo de degradação proteica de fracções de segundo até semanas ( como a actina e miosina ) ou meses ( hemoglobina ). As células possuem múltiplos sistemas proteolíticos usados na degradação das proteínas e complexos mecanismos reguladores que assegurem os processos proteolíticos contínuos são altamente selectivos.

A maioria das proteínas intracelulares são degradadas pela via ubiquitina-proteossoma. Algumas proteínas de superfície e as proteínas extracelulares são tomadas por endocitose e degradadas nos lisossomas que contêm várias proteases e hidrolases. Algumas proteínas citosólicas são degradadas nos lisossomas após sofrerem autofagia e sendo assim englobadas em vacúolos que se fundem com lisossomas. Este processo é acelerado, nas células, pela falta de insulina ou aminoácidos essenciais e, no fígado, pelo glucagon.

Outra família importante de proteases citosólicas são as caspases que fazem a clivagem nos resíduos do ácido aspártico. As caspases, proteases de cisteina, têm uma função crítica na destruição dos componentes celulares no processo de apoptose.

A via ubiquitina-proteossoma liga a ubiquitina às proteínas marcadas para degradação. Este processo de marcação leva as proteínas a serem reconhecidas pela proteossoma que degrada as proteínas ubiquitinadas a pequenos polipeptídeos.

A via ubiquitina-proteossoma utiliza 3 enzimas denominadas E1, E2 e E3. Enquanto E1 e E2 preparam a ubiquitina para a conjugação, a E3 ( ligase ) reconhece o substracto proteico específico e cataliza a transferência da ubiquitina activada para esse substracto proteico.

Factores de transcripção podem ser regulados por alterações na sua localização intracelular. Um exemplo é o que se passa com NF-kB activador transcripcional pro-inflamatório mantido fora do núcleo pela sua interacção com IkB. A fosforilação desta molécula IkB desencadeia a sua degradação, o que leva a que seja reconhecido pela E3 β-transducina repeat containing protein ( β-TRCP ). A IkB é ubiquitinada e degradada rapidamente, permitindo que NF-kB fique livre e se dirija para o núcleo. Este passo é de fundamental importância na aceleração do processo inflamatório.

A via da ubiquitina-proteossoma elimina selectivamente as proteínas defeituosas, seja esse defeito por mutação, erro de síntese ou lesão por radicais de oxigéneo ou desnaturação pelas altas temperaturas.

A via proteolítica extralisossomal dependente de ATP, ubiquitina-proteossoma, é extremamente importante em diversos mecanismos reguladores celulares como transdução de sinal, controlo de ciclo celular, endocitose mediada por receptores, transcripção genética, controlo de qualidade de síntese proteica, fornecimento de aminoácidos em situação de carência nutricional ou condições patológicas, apresentação de antigenes e apoptose.

O sistema proteolítico lisossomal foi o primeiro sistema proteolítico intracelular identificado, mas foram descobertos outros sistemas intracelulares extralisossomais proteolíticos

Proteólise lisossomal

A via da ubiquitina-proteossoma é uma via proteolítica, de fundamental importância para a viabilidade celular, dependente do ATP. A ubiquitina é formada por uma protease de 1000-1500 kDa, formada por subunidades de 34-110 kDa. É formada por um núcleo catalítico cilindríco, denominado proteosoma 20 S e uma porção 19 S onde se localizam as ATPases responsáveis pelo desenovelamento das proteínas a serem degradadas pelas actividades proteolíticas da subunidade 20 S.

A ubiquitinação proteica é uma modificação pós-transducional consistindo esta da adição de uma ou mais moléculas de ubiquitina a proteínas específicas que alteram a função, localização celular ou a direccionam para a degradação no proteosoma.

Proteosoma

Nas células eucarióticas, a principal via de degradação proteica de semi-vida curta é dependente do ATP e da ubiquitina e não uma via lisossómica. Na via ubiquitina-proteossoma são degradadas proteínas reguladoras de certas funções que por isso existem em curtos períodos de tempo, bem como proteínas danificadas ou com erros na sua síntese, que são marcadas para degradação por meio da ligase de cadeia poli-ubiquitina. Estas proteínas assim marcadas são reconhecidas e degradadas pelo proteosoma 20 S após terem sido desenoveladas no proteossoma 19 S. Esta via ubiquitina-proteossoma funciona no citoplasma e núcleo das células. Proteínas associadas ao retículo endoplasmático também são degradadas pela via ubiquitina-proteossoma após o seu retrotransporte para o citoplasma.

A falta de apertado controlo do ciclo de divisão celular está implicado no desenvolvimento tumoral. A via ubiquitina-proteossoma joga uma função fundamental pelo menos em 3 períodos do ciclo de divisão celular. Na transição G1/S, a iniciação da replicação do DNA é desencadeada pela degradação dum inibidor duma cinase dependente da ciclina. Quando este inibidor é fosforilado, uma E3 o reconhece como substracto e dá-se a ubiquitinação e subsequente degradação. Na mitose, a securina ( endoprotease envolvida na separação dos cromossomas ) é ubiquitinada e degradada pela proteossoma. Na fase final da mitose, as ciclinas e factores que controlam a desmontagem do fuso mitótico sofrem degradação pela via ubiquitina-proteossoma.

Esta via ubiquitina-proteossoma também produz peptídeos antigénicos a partir de proteínas de bactérias ou virus. Os peptídeos apresentados às células citotóxicas T nas moléculas do complexo major de histocompatibilidade da classe I resultam de proteólise, limitada dos antigéneos, mediada pelos proteossomas. O γ-interferão estimula este processo induzindo a troca de subunidades catalíticas do proteosoma 20 S. O sistema dependente da via ubiquitina-proteossoma degrada tanto as proteínas celulares ( self ) como as estranhas ( non-self ).

Os peptídeos são apresentados às células citotóxicas T mas apenas os derivados das proteínas estranhas desencadeiam resposta das células T.

DNMT's ( DNA metiltransferases ) e patologias hematopoiéticas

DNMT's ( DNA metiltransferases ) e patologias hematopoiéticas

A metilação do DNA é um regulador importante da expressão genética e organização genómica. A metilação CpG dos genes promotores associa-se ao silenciamento da transcripção.

http://www.youtube.com/watch?v=29doT6Hf2MI

Alterações do padrão normal da metilação do DNA, quer seja aumento local que resulta em silenciamento de genes reguladores do ciclo celular específico, quer seja uma redução global na metilação do DNA, ambos estão envolvidos em muitos tipos de neoplasias.

http://www.youtube.com/watch?v=N2LbVMcQbLk

A metilação CpG envolve a transferência de um grupo metilo para a posição 5 da citosina, originando a 5-metilcitosina   (  5mC  ),  do    dinucleotídeo   CpG,   reacção   esta   catabolizada   pela   DNA metiltransferase ( DNMTs ). Pela acção das proteínas da família TET, e particularmente TET 2, a 5-metilcitosina é convertida em 5-hidroximetilcitosina ( 5hmC ), forma esta de metilação prevalente em neurónios e stem cells embrionárias, entre outras. Embora não se conheça ainda a função da 5hmC, pode esta representar uma via pela qual o DNA metilado em 5mC ser convertido num estado não metilado.

Outras 2 formas de metilação do DNA, relacionadas com 5hmC, foram descritas, nomeadamente 5-formilcitosina  (  5fC  )  e  5-carboxicitosina  (  5caC  ),  sendo  as  proteínas da famíla TET ( TET 1, TET 2 e TET 3 ) envolvidas nestas reacções de metilação

A 5-carboxicitosina, pela acção da timina DNA glicosidase ( TDG ) gera citosina e assim completa a desmetilação.

Alternativamente, 5hmC pode converter-se em 5-hidroximetiluracilo ( 5hmU ), convertendo-se em citosina pela acção da desmetilação mediada pela via da reparação de excisão das bases.

TET 2 está envolvida na modificação oxidativa das bases dos ácidos nucleicos, e particularmente cataliza a conversão de 5-metilcitosina em 5-hidroximetilcitosina.

A família TET é caracterizada por um domínio amino terminal CXXC, com um dedo de zinco, e um domínio carboxi terminal catalítico Fe (II)- e 2-oxoglutarato desoxigenase dependente

TET 2 é expressado em múltiplos tecidos ao nível do mRNA , mas a expressão é mais elevada nas células hematopoiéticas e particularmente granulócitos.

TET 2 está envolvido em processos como regulação positiva da transcripção e diferenciação celular e, por esta razão, as suas mutações frequentemente se envolvem em doenças hematopoiéticas.

TET 2   é  uma   proteína   de   localização   nuclear,   sendo   a   sua   localização   regulada   pelas  proteínas  AID ( activation-induced cytidine deaminase ) e IDAX. Mutação do domínio CXXC da IDAX, altera a localização nuclear da proteína TET 2..

As proteínas da família TET usam o oxigéneo molecular para transferirem um grupo hidroxil para a 5-metilcitosina, originando a 5-hidroximetilcitosina. As proteínas da família TET, para além desta função, também podem oxidar 5hmC a 5fC ou 5caC.

TET 2 tem uma acção importante na manutenção da desmetilação do DNA.

Stress oxidativo aumenta a actividade da TET 2 pois diminui as concentrações de NADPH e NADH promovendo as reacções do ciclo TCA e, dessa forma, a produção de 2-oxoglutarato ( 2-OG ) dependente de IDH.

O ácido ascórbico ( vitamina C ) aumenta a geração de 5hmC por actuar como cofactor de TET 2.

Envolvimento dos genes da família TET em patologias

TET 1  foi  reportado  estar  envolvido  na  leucemia  de  linhagem  mista,  por  ser  o  parceiro  de  fusão com o MLL ( gene da leucemia de linhagem mista ou leucemia mielóide linfóide ) em doentes com LMA com translocação t(10;11)(q22;q23).

TET 2 tem sido relacionado, em caso de mutação, com patologias hematológicas malignas, nomeadamente SMD, LMA primária e secundária e LMMC.

A importância da alimentação não se restringe ao seu conteúdo nutricional, mas também à regulação epigenética dos perfis de expressão dos genes.

A abundância relativa da energia dos metabolitos, permite a célula sentir o seu estado energético e dessa forma uma redução de NADPH e ATP induz a desmetilação do DNA através do ciclo de TCA ( ciclo do ácido cítrico ) sugerindo um papel epigenético como uma ligação mecanística entre o metabolismo energético e o controlo da expressão dos genes.

http://www.youtube.com/watch?v=-TiDIThfej4

A geleia real diminui a metilação do DNA. Um dos aminoácidos mais frequentes na geleia real é a glutamina.

TET 1 e TET 2 estão envolvidos principalmente em neoplasias hematológicas. Glutamina apresenta-se em quantidades superiores em TET 2, comparativamente com TET 1 ou TET 3. Glutamina é o precursor do glutamato, que é o substracto da glutamato desidrogenase que produz 2-oxoglutarato usado pelo TET 2. Em estado catabólico ( redução de ATP, NADPH, hipóxia ) as células aumentam a produção de 2-oxoglutarato por aceleração do ciclo do ácido cítrico e promoção da actividade da glutamina sintetase. Hipóxia é necessária para a manutenção dos nichos das stem cells. Assim pode-se deduzir que o papel da TET 2 na hematopoiese pode ser devido a recursos metabólicos do tecido hematopoiético.

A composição em aminoácidos de TET 1 é semelhante à de TET 2, mas TET 3 tem uma composição diferente. TET 1 e TET 2 tem um importante papel no stemness ( ninho de stem cells – microambiente onde as stem cells são encontradas ) mas não nas células ES ( células ES são células mãe embrionárias derivadas da massa celular interna de um blastocisto, capazes de contribuir na formação de tecidos somáticos e tecidos germinativos ). Queda do nível de TET 1, mas não de TET 2 ou TET 3, impede as células ES de se auto-renovarem e manterem ( a fusão Tel/PDGFRβ também é responsável pela inibição da autorrenovação das células ES ).

Células ES

Neoplasias hematológicas, tais como SMD e doenças mieloproliferativas, resultam da expansão clonal desregulada das stem cells ou progenitores das células hematopoiéticas.

Papel importante na iniciação e desenvolvimento de tipos diferentes de doenças malignas hematológicas, a par com defeitos moleculares que envolvem factores citosólicos de sinalização e transcripção ( JAK, STAT, etc.) tem sido atribuído às vias reguladoras epigenéticas para o estabelecimento da função e diferenciação das stem cells, enquanto que mutações de reguladores epigenéticos ( tais como DNMT3A, isocitrato desidrogenase 1 e 2, TET 2, EZH2, UTX, ASXL 1 ) jogam uma função importante na iniciação e desenvolvimento de distintas patologias hematológicas.

As vias epigenéticas controlam a expressão genética por meio da regulação da metilação do DNA e modificação dos resíduos de histonas dos nucleossomas à volta das quais a dupla hélice do DNA faz rotação.

Verificou-se que na LMA M5 e LMA M4 há uma alta frequência de mutação da DNMT3A, mas pode esta mutação requerer mutações de outros genes chave.

A metilação do DNA é realizada com a ajuda dos DNMT's que catalizam a adição de um grupo metilo no carbono 5 da citosina, produzindo 5-metilcitosina.

Até agora foram descritos 2 tipos de DNA metiltransferases: metiltransferases de novo e metiltransferases de manutenção. Enquanto que a forma de novo produz dinucleotídeos CpG hemimetilados na dupla hélice do DNA e são responsáveis pelo estabelecimento do padrão da metilação, já a forma de manutenção adiciona metilações ao DNA quando uma cadeia já está metilada e é responsável por manter o padrão de metilação estabelecido pela metiltransferase de novo.

Existem 3 tipos de DNMTs: DNMT 1, DNMT 2 e DNMT 3, de acordo com os dados catalíticos da metilação.

http://www.youtube.com/watch?v=tiIy6TNb5cA

DNMT1 ( DNA metiltransferase 1 )

DNMT1, ou metiltransferase de manutenção, tem como principal função a manutenção da metilação em forte associação com a replicação do DNA. Formada por 2 domínios principais: CXXC com um dedo de zinco, que especificamente reconhece CpG não metilado, e um par de domínios BAH ( bromo adjacent homology ).

DNMT1 preferencialmente metila DNA hemi-metilado. DNMT1 joga um papel importante na regulação da auto-renovação das stem cells hematopoiéticas, e o comprometimento das linhagens linfóide versus mielóide. Stem cells hematopoiéticas pobres em DNMT1 diferenciam-se em células mielóides-eritróides mais que linfóides.

DNMT2

É o membro da família DNMT mais conservado. Tem apenas o domínio catalítico e tem a capacidade de ligar SAM ( S-adenosilmetionina ) na mesma conformação de DNMT1. DNMT2 não mostra actividade DNA metilase. DNMT2 não metila o DNA mas metila tRNA Asp-GTC no resíduo citosina 38 na ansa anticodão.

Outros tRNA ( tRNA Val-AAC e tRNA Gly-GCC ) também são metilados por DNMT2

DNMT 3

Há 3 DNMT3 ( DNMT3A, DNMT3B e DNMT3L ) que, comparados com a DNMT1, apresentam um N-terminal mais curto, não apresentando CXXC e domínio BAH, que são substituídos por um domínio PWWP ( prolina-triptofano-triptofano-prolina ) e um domínio ADD.

DNMT3A e DNMT3B são as principais metiltransferases de novo, enquanto que a DNMT3L actua como factor de regulação da DNMT3A.

DNMT3B é expressada a níveis mais altos nas células CD34+ da medula óssea, mas hiporreguladas nas células hematopoiéticas diferenciadas. Na LMA verifica-se um aumento acentuado do nível dos transcriptos de DNMT3B. Uma hiporregulação de DNMT3B pode contribuir para a patogénese da leucemia por indução de hipermetilação regional aberrante.

Mutação de DNMT3B pode provocar desregulação genética associada a linfogénese através de efeitos indirectos na expressão do gene interferente com as normais sinalização, maturação e migração dos linfócitos.

DNMT3L

Parece ter como função a regulação ou ser co-factor de DNMT3A no processo de metilação de novo

A metilação do DNA joga um papel importante na proliferação celular e sua diferenciação bem como na reprogramação celular somática através da alteração da expressão genética.

Anormalidades da DNMT3A em neoplasias hematológicas

Para uma completa evolução de uma leucemia, é necessário a cooperação entre mutações classe I, que envolvem genes codificadores de proteínas das vias de transdução do sinal ( como as tirosina quinases ) e conferem vantagens proliferativas e de sobrevivência para as células hematopoiéticas, e mutações classe II que rompem os factores de transcripção e levam à inibição da diferenciação hematopoiética e, subsequente, apoptose. Para além destes 2 grupos , evidências recentes apontam para uma nova categoria de mutação genética associada com regulação epigenética, tais como as mutações de DNMT3A, IDH 1, IDH 2 e TET 2, sendo a incidência destas mutações considerável nas neoplasias hematológicas, resultando em alterações da metilação do DNA e/ou perfis de modulação das histonas com aberração dos padrões de expressão genéticos.

Este terceiro tipo de mutação é frequentemente encontrado em doentes idosos com LMA, que apresentam hiperleucocitose, infiltração dos órgãos mais severa e, dessa forma, prognóstico mais grave.

Na LMA M4 e M5 uma variedade de mutação foi identificada em quase todos os domínios da DNMT3A mas, no entanto, uma mutação em R882 foi observada em todos os casos. Clinicamente os casos de LMA com mutação DNMT3A são preferencialmente associados com LMA M4 ou M5, com início tardio da doença, hiperleucocitose e prognóstico extremamente severo em termos de sobrevivência média e período assintomático.

Desregulação do TET 2 e doenças mielóides malignas

Desregulação do TET 2 e doenças mielóides malignas

Em muitos cancros, incluindo doenças hematológicas malignas, verifica-se o aparecimento de mutações aberrantes do DNA, sendo a hipermetilação dos genes supressores tumorais uma dessas aberrações. Esta característica levou à procura, e posterior descoberta, de agentes com a capacidade de reverter a hipermetilação, como sejam inibidores da metiltransferase do DNA, que se tem vindo a tornar encorajante no tratamento da SMD e algumas leucemias agudas.

O gene TET 2 α-cetoglutarato dependente é fortemente relacionado com o TET 1, cujo produto proteico é responsável pela conversão do 5mC ( 5- metilcitosina ) em 5hmC ( 5-hidroximetilcitosina ) no DNA. Mutações somáticas no gene TET 2 ocorrem com frequência nos doentes com doenças mielóides malignas, incluindo SMD, LMA, neoplasias mieloproliferativas e LMMC.

Mutações de TET 2 associam-se com baixos níveis de 5hmC comparativamente com controlos saudáveis.

Verificou-se que a desregulação de TET 2 está associada com a hipometilação mais do que com a hipermetilação. Conclui-se que TET 2 joga um importante papel na mielopoiese normal, existindo uma forte associação entre doenças mielóides malignas e a perda da função catalítica do TET 2. Também está proposto que o nível de 5hmC celular de doentes com doenças malignas mielóides pode ter significado prognóstico independente e proporcionar a base terapêutica destas patologias.

Na LMA, mutações do gene do metabolismo do citrato ( isocitrato desidrogenase 1 e 2 – IDH 1 e IDH 2 ) foram demonstradas terem papel relevante por interferência da função do gene TET 2.

Mutações de IDH1 e IDH 2 resultam em produção de 2 hidroxiglutamato e inibição da função de TET 2

TET 2 ( ten eleven translocation 2 ou metilcitosina desoxigenase 2 ) é o gene que dá as instruções para o fabrico de uma proteína envolvida na regulação do processo de transcripção, primeiro processo da síntese proteica.

Embora a proteína TET 2 exista em todo o organismo, ela joga um papel particularmente importante na produção sanguínea a partir das stem cells hematopoiéticas, localizadas na medula óssea, e que originam as 3 linhas celulares sanguíneas ( leucócitos, eritrócitos e plaquetas ). A proteína TET 2 actua como supressor tumoral prevenindo as células de crescerem e dividirem de forma descontrolada.

Mutação somática do gene TET 2 foi observada em alguns doentes com trombocitémia essencial. Nesta condição patológica, a mutação do gene TET 2 altera a proteína TET 2 de formas diferentes, resultando todas elas numa proteína não funcional.

Na policitémia vera verifica-se, em alguns casos, a ocorrência da mutação TET 2, resultando na produção de uma proteína não funcional. Isto ocorre em cerca de 16% dos casos de policitémia vera.

Mutação do gene TET 2 associa-se à mielofibrose primária, sendo desconhecido o papel desta mutação na patologia.

Mutações do gene TET 2 associam-se ainda a outras patologias tumorais, como sejam leucemias e síndrome mielodisplásico. A perda da proteína TET 2 nas stem cells hematopoiéticas pode levar ao crescimento descontrolado e divisão destas células.

Cromossoma 4

O gene TET 2 localiza-se no braço longo do cromossoma 4, na posição 24. A mutação deste gene foi inicialmente identificada em neoplasias mielóides, com delecção ou dissomia uniparental, na localização 4q24.

Como se referiu anteriormente, o gene TET 2 codifica uma proteína que suprime o crescimento tumoral. Este gene TET 2 está mutado em cerca de 16% dos doentes com policitémia vera e 22% dos doentes com SMD ou LMA.

Em cerca de 60% dos doentes com o gene TET 2 mutado, associam-se outras mutações e anormalidades cromossómicas protectoras, conhecidas como risco citogenético “bom”. Em comparação, apenas cerca de 40% dos doentes com gene TET 2 normal, não mutado, apresentam risco citogenético “bom”.

TET 2 localiza-se numa região ( 4q24 ) que apresenta recorrentes microdelecções e cópias de perda neutral de heterozigocidade ( LOH ) em doentes com várias malignidades mielóides. Mutações somáticas do gene TET 2 são frequentemente observadas em doentes com SMD, neoplasias mieloproliferativas, síndrome mieloproliferativo mielodisplásico, LMMC, LMA e LMA secundária.

Stem cells hematopoiéticas  com alterações em TET 2 são capazes de reconstituirem a multilinhagem sanguínea e possuem uma vantagem competitiva sobre as stem cells normais, resultando numa hematopoiese aumentada tanto na linhagem linfóide como mielóide.

Alteração de TET 2 atrasa a diferenciação das stem cells hematopoiéticas e desvia o desenvolvimento para a linhagem monocítica/macrofágica.

TET 2 tem um papel crítico na regulação da expansão e função das stem cells hematopoiéticas, provavelmente pelo controlo dos níveis de 5hmC nos genes importantes no envolvimento da auto-renovação, proliferação e diferenciação das stem cells hematopoiéticas.

A incidência da mutação TET 2 associa-se com a idade, sendo maior nos doentes com mais de 50 anos ( 17% dos doentes com mais de 50 anos e 9% nos doentes com menos de 50 anos apresentam a mutação TET 2 ).

A SMD é uma alteração clonal da hematopoiese que se caracteriza por displasia , hematopoiese ineficaz e citopenias periféricas. A evolução da SMD para LMA ocorre em cerca de 25% dos casos.

A proteína TET 2 é um membro da família das proteínas TET constituída por 3 proteínas ( TET 1, TET 2 e TET 3 ) que partilham entre si 2 domínios fortemente conservados. A proteína TET 1 foi implicada na leucemia como parceiro de fusão do produto do gene MLL ( gene da leucemia de linhagem mista ou leucemia mielóide linfóide ) na translocação cromossómica t(10;11)(p12;q23) e foi demonstrado ser capaz de hidroximetilação e assim contribuir para a metilação da citosina e regulação epigenética do gene. Foram identificadas mutações do gene TET 2 em 19-26% dos casos com SMD e cerca de 50% dos casos de LMMC, sendo desta forma esta mutação uma das mais frequentes nestas neoplasias mielóides.

Importante assinalar que embora as mutações TET 2 sejam um acontecimento precoce deste tipo de doenças ( mieloproliferativas e mielodisplásicas ) e surjam mesmo lesões pré-JAK 2 nas neoplasias mieloproliferativas ( policitémia vera, trombocitose essencial e mielofibrose primária ), as mutações TET 2 e JAK 2 podem ocorrer, e ocorrem na maioria dos casos, independentemente uma da outra. Isto é sublinhado nos casos em que a mutação TET 2 ocorre apenas na altura da transformação leucémica mielóide das neoplasias mieloproliferativas.

Na maioria dos casos, a mutação do gene TET 2 causa inactivação da proteína TET 2, sugerindo um papel de supressor tumoral desta proteína TET 2. De salientar que o mRNA do TET 2 é fortemente expressado nas células progenitoras mielóides normais, granulócitos normais ou eritrócitos normais em contraste com o que se verifica de reduzida expressão de TET 2 naquelas células em doentes com SMD.

As regiões conservadas na família de proteínas TET ( regiões cons'd 1 e 2 ) são implicadas na conversão de 5-metilcitosina para 5-hidroximetilcitosina e correspondem, essas regiões, aos amino-ácidos 1104 - 1478 e 1845 – 2002, respectivamente.

Múltiplas mutações podem ocorrer no mesmo doente, simultaneamente.

Significativo o facto de SMD com a anormalidade 5q- não costumar apresentar a mutação TET 2.

Estado citogenético, sexo, subtipos WHO, transformação para LMA e score IPSS não se correlacionam, habitualmente, com a mutação TET 2. Também não se atribui associação clínica com o tamanho da mutação clonal ou a presença de mutação singular versus múltipla do TET 2

Homozigocidade para a mutação TET 2 é definida como uma abundância relativa de mutação ( RMA ) superior a 65%

A sobrevivência global não é afectada pela homozigocidade, existência ou não da mutação TET 2, alto ou baixo nível da mutação, presença de mutação única ou múltipla ou score IPSS.

Pode-se dizer que a presença da mutação TET 2 não influencia a sobrevivência global destes doentes. Idade avançada do doente, classificação WHO e subtipo citogenético são as únicas variáveis que significativamente afectam a sobrevivência global destes doentes.

As mutações TET 2 têm sido identificadas numa gama de doenças malignas mielóides e são das mais frequentes mutações genéticas associadas a SMD, sendo estas mutações de significado prognóstico ainda controverso.

Um dado importante é a variedade de clones com baixa abundância de mutação TET 2.

A existência de baixo, mas significativo, número de clones minor é indicativa da evolução clonal da doença. Este facto é sublinhado por vários casos de mutações múltiplas, onde se observa uma mutação dominante, e outras populações pouco abundantes, sugerindo uma competição clonal.

Foi sublinhada a ocorrência de mutação TET 2 em células CD 34, reforçando a ideia desta aberração genética ser uma lesão inicial da doença.

A mutação TET 2 é ubiquitativa entre as linhagens mielóides e linfóides, sugerindo que tal mutação ocorre precocemente na hematopoiese. A mutação TET 2, como anteriormente se referiu, precede a mutação JAK2V617F nas neoplasias mieloproliferativas.

Mutações TET 2 e aberrações genómicas afectando o locus 4q24 são acontecimentos independentes, e podem não ocorrer os dois simultaneamente, como é o caso do surgimento de LOH ( lost of homozygosity ) e mutação TET 2 em alguns doentes com SMD.

Uma  característica  importante  da  SMD  é  o  aumento  da  frequência  da dissomia uniparental ( UPD ) que é uma medida indirecta da instabilidade genómica. Não se verificam diferenças significativas entre doentes com mutação TET 2 ou sem ela na frequência das UPD, sugerindo que os defeitos TET 2 não contribuem para a instabilidade genómica geral.

Não há evidência que os casos com homo ou hemizigotia para a mutação TET 2 apresentam reduzida sobrevivência, comparativamente com os casos de mutação heterozigótica, como se poderia esperar se o TET 2 aberrante orientasse a doença independentemente. A falta de correlação entre a presença de mutação de TET 2 e o prognóstico da SMD sugere que vários outros factores afectam o fenótipo do SMD, apesar da aquisição da mutação somática TET 2 ser um acontecimento relevante na patogenia e transformação de SMD.

Nas neoplasias mieloproliferativas o aparecimento da mutação TET 2 associa-se com a transformação para LMA. 

Manchas de Gumprecht

Sombras de Gumprecht

Sombras de Gumprecht, também chamadas de manchas de Gumprecht, smudge cells ou basket cells, são artefactos presentes no esfregaço de sangue periférico correspondentes a restos de células frágeis, que foram lesadas no processo técnico de estiramento do esfregaço sanguíneo.

Na maioria dos casos as manchas de Gumprecht representam restos linfocitários, mas a linhagem celular é de muito difícil estabelecimento, dado a célula não se apresentar intacta.

As manchas de Gumprecht representam, desta forma, pequenos linfócitos maturos caracterizados por uma fragilidade peculiar da membrana celular, que leva frequentemente à rotura da célula durante a execução do esfregaço sanguíneo, com formação de restos linfocitários. São portanto células mortas nas quais é impossível fazer a distinção morfológica do tipo celular, mas que frequentemente são de origem linfocitária, podendo também ser derivadas dos neutrófilos, que aparecem frequentemente em doentes com LLC, mas podem também aparecer em outras patologias, e em crianças pequenas sem patologia significativa.

Na realidade, smudge cells são restos de material nuclear condensado, sem citoplasma identificável. O procedimento técnico de adicionar uma gota de albumina sérica por cada 4-5 gotas de sangue, antes do estiramento do esfregaço, resulta no evitar da formação destas manchas de Gumprecht.

As manchas de Gumprecht são principalmente vistas em patologias que se caracterizam por fragilidade linfocitária, tais como LLC ou mononucleose infecciosa.

Estudos apontam, mas precisam de ser confirmados, para o número das manchas de Gumprecht, em valor percentual comparativamente com os linfócitos, se correlacionarem com a sobrevivência nos doentes com LLC.

A formação de smudge cells correlaciona-se inversamente com a expressão da vimentina, uma proteína filamentosa do citoesqueleto, e que parece ser um marcador de prognóstico na LLC.

A  percentagem  de  smudge  cells  é  superior  nos  doentes  com  mutação  do  gene  da cadeia  pesada  da  imunoglobulina,  comparativamente  com  aqueles  doentes  sem  esta mutação ( as imunoglobulinas são formadas pela acção de 3 genes diferentes: um para a cadeia pesada e um para cada uma das cadeias leves, κ e λ ). Importante referir o facto que nos casos de LLC a maioria das células neoplásicas são linfócitos B ao contrário do que acontece no indivíduo saudável em que a maioria dos linfócitos são T.

Quando a LLC avança, surge hipogamaglobulinemia ( carência total ou parcial de anticorpos ). A diminuição do veículo de resposta imunitária, as imunoglobulinas ou sua fracção gama, confirmam o diagnóstico de LLC.

A LLC é uma doença cumulativa e não proliferativa, isto é, os linfócitos neoplásicos que são B e não T, CD 5+, têm um turn over lento, com uma semi-vida muito maior que a do linfócito B normal, talvez por apresentarem um bloqueio da maturação. Na LLC os linfócitos acumulam-se, primeiramente na medula óssea, e passando posteriormente para o sangue periférico, linfonodos, baço e fígado.

A vimentina, uma proteína de 52-58 KDa, da família dos filamentos intermediários, compõe o citoesqueleto juntamente com outras proteínas como a actina e os microtúbulos.

Um monómero de vimentina, bem como todos os outros filamentos intermediários, tem um domínio central em α-hélice, coberto em cada terminação por domínios não helicoidais amino e carboxi. Dois monómeros se retorcem, um sobre o outro, para formarem um dímero em espiral. Dois dímeros formam um tetrâmero que, por interacção com outros tetrâmeros, formam uma folha β.

Vimentina

O alto grau de insolubilidade da vimentina sugere a sua função estrutural no citoplasma como forma de ancoragem da posição dos organelos no citosol. A vimentina está ligada ao núcleo celular, mitocôndrias e retículo endoplasmático. Evidências existem de que a vimentina se associa à membrana nuclear e à membrana citoplasmática, mantendo o núcleo na sua posição e o fuso mitótico, durante toda a vida celular. A natureza dinâmica da vimentina é importante para oferecer flexibilidade à célula. A resiliência que as células têm é proveniente da vimentina, resiliência essa ausente nas redes de filamentos de microtúbulos e actina quando sob stress mecânico in vivo.

A vimentina é a principal proteína responsável pela forma celular, integridade do citoplasma e estabilização das interacções do citoesqueleto. É a vimentina que controla o transporte da LDL-colesterol do lisossoma para o local de esterificação. As células passam a armazenar uma percentagem muito menor de lipoproteínas do que as células normais com vimentina. Essa dependência do armazenamento da vimentina parece ser o primeiro processo duma função biológica em qualquer célula que depende duma rede celular de filamentos intermediários. Este tipo de dependência tem ramificações em células da supra-renal que dependem de ésteres do colesterol derivados do LDL.

A vimentina é fundamental na manutenção da potência do citoesqueleto responsável pela forma da célula e sua resistência a forças externas.

O microambiente extracelular tem a capacidade de modular a organização e expressão dos filamentos intermediários, como a vimentina, durante os diferentes processos pelos quais a célula passa, como adesão, proliferação, migração e diferenciação celular.

A vimentina apresenta-se dispersa por todo o citoplasma e processos celulares, como redes bem definidas, sendo mais densa nas regiões mais distais destes processos.

Vimentina

A vimentina é um, de entre vários, filamento intermediário existente e que faz parte do citoesqueleto.

http://www.youtube.com/watch?v=ksB-a46lVnw

As células eucarióticas são estruturadas por um complicado sistema de interacções entre os componentes do citoesqueleto e os componentes da membrana plasmática. O comportamento dinâmico e a estabilidade mecânica da arquitectura citológica depende de um sistema de filamentos interconectados, formados pelos microtúbulos constituídos por heterodímeros de α/β-tubulina, microfilamentos formados de actina e filamentos intermediários formados a partir de proteínas fibrosas.

As lâminas nucleares são filamentos intermediários formadoras de um revestimento fibroso no interior da membrana nuclear e que promovem locais de ligação para os cromossomas na interfase e participam na formação de complexos multiproteicos nos poros da membrana nuclear.

A actina e a tubulina são proteínas globulares altamente conservadas, com ligação a nucleotídeos e actividade de hidrólise conhecida, enquanto que os filamentos intermediários são proteínas fibrosas com uma pouco conhecida actividade enzimática. São caracterizados por uma grande região central em α-hélice, denominada “rod” ou “bastão”.

É uma estrutura bem conservada mas que diverge acentuadamente na sua sequência primária com excepção de 2 regiões altamente conservadas nas regiões finais da α-hélice. Os domínios amino-terminais que não fazem parte da α-hélice contêm diversos resíduos de amino-ácidos básicos, com a possibilidade de interactuarem com os domínios ácidos da α-hélice, assim como de formarem locais de ligação com vários componentes celulares incluindo locais de fosforilação.

Os  filamentos  intermediários  citoplasmáticos  agrupam-se  classicamente  em  4  classes ( tipo I a IV ) baseando-se essa classificação na homologia de suas sequências. As lâminas nucleares formam a classe V e actualmente considera-se haver uma classe VI. A vimentina pertence à classe III e é capaz de se polimerizar com várias proteínas como a desmina, proteína ácida fibrilar glial, periferina, NF-L, α-internexina e nestina.

http://www.youtube.com/watch?v=FoDniO676Dw

A vimentina é uma proteína presente nas células mesenquimais, de 52-58 KDa, que pode ser fosforilada no resíduo tirosina em várias condições. A fosforilação de proteínas dos filamentos intermediários, como é o caso da vimentina, é uma via que gera várias subunidades solúveis que depois de serem desfosforiladas se apresentam prontas para nova fosforilação. Desta forma a fosforilação-desfosforilação dos filamentos intermediários permitem a modulação dinâmica das redes de filamentos intermediários. A subunidade regulatória da proteína fosfatase A2 e a proteína cinase-α, que se liga a RhoA, têm sido relacionadas com a fosforilação da vimentina in vitro e são co-localizadas com os filamentos intermediários da vimentina in situ.

A vimentina é o maior componente estrutural dos filamentos intermediários em células de origem mesenquimatosa. As subunidades de vimentina polimerizam-se formando um complexo sistema de redes com uma organização radial que se estende centrifugamente até ao núcleo.

Vimentina-actina

As redes de vimentina são coincidentes na localização com as redes de microtúbulos, o que sugere que estes filamentos interagem uns com os outros.

Vimentina-tubulina

A polimerização-despolimerização da vimentina é controlada por um complexo sistema de quinases e fosfatases. A vimentina pode ser fosforilada em serina e treonina. Também o factor de crescimento derivado das plaquetas ( PDGF ) pode induzir a fosforilação da vimentina em tirosina e dessa forma promover a despolimerização em certos segmentos.

Foi demonstrado que a vimentina está relacionada com o controlo da rigidez celular, sendo que a falta de vimentina daria uma maior rigidez às células.

Estudos sugerem existir uma correlação entre a morfologia celular e a expressão de genes do citoesqueleto.

Tubulina e actina encontram-se na célula nas formas polimerizada e não polimerizada, enquanto que a vimentina encontra-se na célula fundamentalmente em forma polimerizada. A vimentina é uma fosfoproteína, sendo a taxa de fosforilação da vimentina maior durante a mitose e estimulação hormonal. A diminuição da taxa de síntese da vimentina parece ser feita ao nível da tradução, porque a actividade do mRNA para a síntese da vimentina é sempre idêntica.

Acúmulo de vimentina fosforilada nas células correlaciona-se com o acúmulo das células em mitose.

Os níveis da expressão da vimentina correlacionam-se com a forma celular e comportamento da mobilidade das células.

O alto grau de sensibilidade da vimentina sugere a função estrutural no citoplasma como forma de suporte e ancoragem da posição dos organelos. A vimentina liga-se ao núcleo, ao retículo endoplasmático e às mitocôndrias, seja lateral ou terminalmente. A vimentina também liga as membranas nuclear e citoplasmática por forma a manter a posição do núcleo e do fuso mitótico durante o tempo de vida da célula. Na mitose, a vimentina é fosforilada no seu domínio amino terminal e dispersa-se em agregados contendo formas filamentosas.

A flexibilidade celular é, em grande parte, devida à natureza dinâmica da vimentina. A vimentina oferece às células a resiliência, ausente nas redes de filamentos dos microtúbulos e actina, quando sofrem stress mecânico in vivo. A vimentina é uma proteína do citoesqueleto que é responsável pela integridade celular, sendo que as células sem vimentina ficam muito frágeis.

Leucemia linfocítica crónica - LLC

Leucemia linfocítica crónica

Leucemia linfocítica crónica ( LLC ) é uma patologia que resulta da proliferação neoplásica de linfócitos B maturos, que infiltram a medula óssea e circulam no sangue periférico, e que afecta, predominantemente, indivíduos de meia idade ou idosos, atingindo uma incidência de dez por cem mil, por ano, em pessoas de 65 anos, atingindo mais os brancos que os negros ou asiáticos.

Nas fases iniciais da doença, apresenta-se praticamente assintomática sendo, com o evoluir da doença, observados linfadenopatias, hepatopatia e esplenomegalia. Há uma alteração da função B e T e diminuição da concentração das imunoglobulinas. Fenómenos autoimunes também são frequentes. Linfocitose absoluta de 5000/μl ou mais de 10000/μl é critério de estabelecimento de diagnóstico de LLC.

O estudo do sangue periférico é essencial no diagnóstico de LLC, sendo o estudo da medula óssea ( mielograma ) de menor importância em comparação com a biópsia óssea, que dá informação importante tanto para o diagnóstico como para o prognóstico.

O esfregaço do sangue periférico mostra uma população uniforme de pequenos linfócitos maturos, com núcleo redondo, cromatina em grumos ( frequentemente semelhando um mosaico ).

Sombras de Gumprecht são dados muito indicativos mas não patognomónicos. Com o avanço da doença, anemia e trombocitopenia podem surgir.

Sombras de Gumprecht

Anemia hemolítica autoimune pode instalar-se, aparecendo esferócitos e Coombs directo positivo. Pode ser observada policromasia e reticulocitose. Trombocitopenia pode verificar-se e ser por destruição autoimune das plaquetas. O esfregaço do sangue periférico mostra geralmente eritrócitos normais.

Doentes com LLC podem apresentar prolinfócitos ( células com nucléolos proeminentes e citoplasma abundante ).

Muitos pequenos linfócitos, uma mancha de Gumprecht e um prolinfócito

No mielograma verifica-se haver hipercelularidade, com número aumentado de linfócitos maturos, com morfologia uniforme. Células hematopoiéticas normais são reduzidas e há uma queda contínua com a progressão da doença. Valores de 30% ou 40% de linfócitos na medula óssea têm sido sugeridos para estabelecer o diagnóstico de LLC, mas ainda não foi estabelecido um valor de forma consensual, sendo no entanto um valor de 30%, em amostra não hemodiluída, um valor bem fundamentado.

Medula óssea infiltrada por linfócitos em LLC

Quando a LLC é complicada por anemia hemolítica autoimune a medula óssea apresenta uma hiperplasia eritróide e, nos casos acompanhados por trombocitopenia autoimune há um aumento do número de megacariócitos . Quando a aplasia eritrocitária pura complica LLC verifica-se haver uma falta dos precursores eritrocitários para além dos proeritroblastos.

Nas situações de transformação prolinfocitóide da LLC, número aumentado de prolinfócitos é observado na medula óssea. Quando infiltração ocorre, as células usualmente têm a morfologia dos linfomas  pleomórficos  de  grandes  células  B, frequentemente  com  sinais   de  imunoblastos  ( imunoblastos são células grandes, com citoplasma fortemente basófilo e grande núcleo com um nucléolo central grande proeminente ) .

Na biópsia óssea, usualmente, a grande maioria das células neoplásicas são pequenos linfócitos, ligeiramente maiores que os linfócitos normais que apresentam núcleos com cromatina em grumos, nucléolos insignificantes, e pouco citoplasma.

Para  além  dos  pequenos  linfócitos,  observam-se  ainda  prolinfócitos  e  para-imunoblastos ( células de tamanho médio com muito citoplasma não muito basofilico, um núcleo grande com nucléolos proeminentes ).

Quatro padrões histológicos são vistos na infiltração medular na LLC: intersticial, nodular, difusa e mista de intersticial e nodular. O padrão difuso é o de pior prognóstico de todos os tipos de infiltração, sendo o padrão intersticial acompanhado de menor sobrevivência comparativamente com o padrão nodular.  

Elevação de CA 19.9 provocada pelo consumo exagerado de chá

Elevação de CA 19.9 provocada pelo consumo exagerado de chá

O marcador tumoral CA 19.9 ( antigene associado a carbohidrato sérico, sialil-Lewis a ) é comummente utilizado para neoplasias biliopancreáticas, bem como carcinomas colorretais e outras patologias benignas e malignas.

O CA 19.9 sérico é o marcador tumoral mais utilizado para o cancro do pâncreas.

Na literatura, foi reportado um caso de aumento da concentração de CA 19.9, em indivíduo saudável, causado pelo consumo exagerado de chá.

O CA 19.9 é um monossialicogangliosídeo que pode elevar-se ligeiramente com algumas doenças benignas, atingindo níveis muito altos em patologias malignas como adenocarcinoma do pâncreas, carcinoma hepatocelular e cancro colangiocelular, e níveis elevados, se bem que menos elevados que naquelas doenças, são verificadas em cancros gástricos e colorretais.

Valores de até 140 UI/ml podem ser observados em doença inflamatória intestinal, mas nunca superior a esse valor.

De salientar que apenas indivíduos do grupo sanguíneo Lewis são capazes de apresentar concentrações elevadas de CA 19.9. Entre as causas não malignas, icterícia obstrutiva associa-se, frequentemente, com um aumento de CA 19.9 e verifica-se uma descida da concentração de CA 19.9 com a diminuição da icterícia, nos casos benignos, e principalmente em doentes com doenças malignas.

Células normais do epitélio biliar secretam mucinas que transportam CA 19.9. Elevação inespecífica de CA 19.9 sérica pode verificar-se por hipersecreção inflamatória e vazamento das secreções biliares no soro.

Verifica-se uma correlação estreita entre o CA 19.9 sérico e os parâmetros normalmente utilizados para caracterizar uma colestase, ou entre o CA 19.9 sérico e a fosfatase alcalina e a bilirrubinemia na insuficiência hepática aguda, hepatite aguda ou hepatopatias crónicas de qualquer etiologia.

O mecanismo pelo qual a elevação do CA 19.9 no soro se verifica parece ser uma provável hipersecreção pelas células epiteliais normais, nos processos inflamatórios.

Os flavonóides que formam o chá são anti-oxidantes potentes. O extracto de chá verde é um bioflavonóide potente no combate aos radicais livres. Uma classe de bioflavonóides é a dos polifenóis. De entre os polifenóis existentes no chá verde ( epicatequina, 3-galato de epicatequina, epigalocatequina e 3-galato de epigalocatequina ), o GEGC é um potente anti-oxidante, cerca de 300 vezes mais potente, nessa acção, que a vitamina E. Parece que os flavonóides actuam numa vasta gama molecular, que influencia o crescimento celular e as vias da angiogénese. Nos doentes que apresentam subida de CA 19.9, por vezes para valores muito elevados da ordem de 1400 UI/ml, a retirada do consumo de chá leva a uma queda abrupta, para valores normais ou muito próximos do normal, em menos de 1 mês, sendo que possíveis sintomas que tenham aparecido ( dor epigástrica, anorexia, etc.) desaparecem. O mecanismo que relaciona o hiperconsumo de chá com a elevação da concentração de CA 19.9 é desconhecido, mas parece haver uma susceptibilidade individual à anormal secreção de CA 19.9 desencadeada pelo excessivo consumo de chá.

O valor do CA 19.9 no diagnóstico de carcinoma do pâncreas é pouco significativo para a população saudável. Estudos, realizados no Japão e na Coreia do Sul, mostraram que apenas num muito reduzido número de indivíduos com aumento de CA 19.9 ( sem outras sintomatologias, alterações analíticas ou de outros exames complementares ) se encontra carcinoma do pâncreas ( 4 em 12840 doentes no estudo japonês; 4 em 70940 pacientes no estudo sul coreano ). O CA 19.9 como teste de screening para o carcinoma pancreático é de muito pouca valia em indivíduos saudáveis.

O CA 19.9, primeiramente utilizado para o cancro do cólon, tornou-se de maior uso no despiste  do  cancro  do  pâncreas. Utiliza-se   para   o   follow-up   do   tratamento  do cancro  ( pâncreas, colorretal, hepatoma, etc. ) ou para diferenciar diversos tipos de cancro, como o cancro dos ductos biliares e cancro do pâncreas. Uma nova subida dos valores de CA 19.9 podem indicar uma recorrência do cancro do pâncreas.

Valores superiores a 37 UI/ml são sempre considerados anormais, mas a razão desta anormalidade pode ser maligna, benigna ou irrelevante ( como é o caso da intoxicação pelo chá ).

Os valores de CA 19.9 são paralelos à gravidade da doença, sendo tanto mais altos quanto mais avançada estiver a doença.

A concentração de CA 19.9 também se correlaciona com o tratamento, verificando-se diminuição dos valores nos tumores que foram extraídos cirurgicamente, e há também correlação do valor de CA 19.9 com a localização do tumor, sendo mais elevado o valor de CA 19.9 nos localizados no corpo e mais baixos nos de localização na cauda, bem como nos locais de metástases, sendo as metástases hepáticas as que cursam com valores mais elevados de CA 19.9.

Uma causa de elevação de CA 19.9 é o quisto dermóide do ovário, mais frequente nas mulheres com 20 a 40 anos. A torsão do quisto dermóide pode ocorrer e ser uma causa do aumento do valor de CA 19.9, e valores elevados podem predizer a extensão da necrose tecidular.

CA 19.9 é derivado de uma via aberrante durante a produção da sua contra-parte, disialil-Lewis-a, que tem um resíduo de ácido siálico extra ligado através da ligação 2 → 6. Disialil-Lewis-a expressa-se normalmente no epitélio dos órgãos digestivos, serve de ligando para os monócitos e macrófagos e ajuda na imunovigilância. Silenciamento epigenético do gene para a 2 → 6 sialil transferase nas fases iniciais da carcinogénese leva a uma síntese anormal e acumulação de sialil-Lewis-a ( CA 19.9 ). CA 19.9 pode também jogar um papel na invasão/metastização, pois sabe-se que é um ligando para E-selectina das células endoteliais, responsável pela adesão celular.

Apenas doentes do grupo sanguíneo Le(α+β-) ou Le(α-β+) expressam CA 19.9.

O fenótipo Le(α-β-) encontra-se em 5-10% da população e falta-lhes a enzima 1,4-fucosil transferase requerida para a produção epitopo do antigene, e assim limita a utilização do CA 19.9.

Os valores de CA 19.9 correlacionam-se bem com a ressetabilidade do tumor, a metastização, o estadio e a resposta terapêutica dos carcinomas do pâncreas.

Verificou-se que quanto mais elevado o valor de CA 19.9 for, pre-operatoriamente, pior o prognóstico e mais baixa a sobrevivência do doente.

A semi-vida do CA 19.9 é de cerca de 14 horas.

Hiperbilirrubinemia associa-se a um aumento de CA 19.9, tanto em patologias benignas como malignas. A inflamação associada com icterícia obstrutiva aumenta a proliferação das células do epitélio biliar, com subsequente aumento na absorpção sistémica de CA 19.9. O valor de CA 19.9 normaliza após a desobstrução biliar, nos casos de colestase benigna, mas nos casos de obstrução maligna permanece elevada devido à persistente produção de CA 19.9 pelas células tumorais proliferantes.

O aumento do valor de CA 19.9 associa-se a um aumento do valor da VS, mas este aumento não é necessariamente paralelo.

Verificou-se, também, em doentes diabéticos, que um aumento do CA 19.9 é acompanhado por um aumento da HgA1c.