Técnica citoquimica para avaliação da fosfatase alcalina leucocitária

 Fosfatase alcalina leucocitária

A coloração da fosfatase alcalina leucocitaria não pode ser executada em sangue com anticoagulante, nomeadamente EDTA e sim deve ser feita a partir dum esfregaço de sangue periférico colhido directamente do dedo?

A coloração da fosfatase alcalina leucocitária (FAL) é uma técnica utilizada para avaliar a atividade enzimática nos leucócitos, especialmente nos neutrófilos. Esta coloração é sensível a alguns tipos de anticoagulantes, como o EDTA, que podem inibir a atividade enzimática e, portanto, interferir nos resultados.

Por esta razão, é preferível realizar a coloração da FAL em esfregaços de sangue periférico colhidos diretamente do dedo, onde o sangue não foi tratado com anticoagulante. Este método permite uma avaliação mais precisa da atividade enzimática nos leucócitos.

Portanto, para obter resultados mais fiáveis, é aconselhável utilizar sangue fresco, sem anticoagulante, para a coloração da fosfatase alcalina leucocitária. 🩸🔍

O que acontece à fosfatase alcalina leucocitaria quando feita a partir de sangue colhido para tubo de EDTA?

Quando a coloração da fosfatase alcalina leucocitária (FAL) é realizada em sangue colhido num tubo com EDTA, a atividade enzimática pode ser inibida. O EDTA é um anticoagulante que quelata o cálcio e outros metais necessários para a atividade enzimática, incluindo a da fosfatase alcalina. Como resultado, a coloração pode mostrar uma atividade reduzida ou mesmo ausente, levando a resultados falsamente baixos.

Por isso, para uma avaliação precisa da FAL, é preferível utilizar sangue fresco colhido sem anticoagulantes, como em esfregaços de sangue periférico colhidos diretamente do dedo. Desta forma, evita-se a interferência do EDTA e obtêm-se resultados mais fiáveis.

Parâmetros estatísticos usados para comparação de 2 métodos analíticos

 Quais os principais parâmetros analíticos a usar numa comparação entre 2 métodos de análise?

Quais os parâmetros estatísticos mais importantes a serem avaliados quando se pretende fazer a comparação entre 2 métodos analiticos?

Ao comparar dois métodos analíticos, é essencial avaliar diferentes parâmetros estatísticos para determinar a precisão, exatidão e concordância entre os métodos. Os principais parâmetros a serem considerados incluem:

### 1. **Viés (Bias)**

   - Mede a diferença sistemática entre as médias dos dois métodos. Se um método é consistentemente maior ou menor do que o outro, há um viés.

   

### 2. **Precisão (Reprodutibilidade ou Repetibilidade)**

   - Avalia a variação nos resultados quando o mesmo método é repetido sob as mesmas condições. Isso pode ser medido usando o **desvio padrão (SD)** ou o **coeficiente de variação (CV)**.

### 3. **Exatidão**

   - Mede o quão próximo os resultados de ambos os métodos estão de um valor de referência ou padrão aceito.

### 4. **Correlação de Pearson (r)**

   - Indica o grau de associação linear entre os dois métodos. Valores próximos de 1 indicam forte correlação, mas **não garante concordância**, apenas associação.

### 5. **Teste de Bland-Altman (Plot de Diferença)**

   - Avalia a concordância entre os dois métodos, analisando a diferença entre eles em função da média. Este método é preferido para entender a diferença sistemática e os limites de concordância entre dois métodos.

### 6. **Regressão Linear (Deming ou Passing-Bablok)**

   - A **regressão Deming** ou **Passing-Bablok** são adequadas quando há erros em ambos os métodos. A equação da reta de regressão (inclinação e intercepto) ajuda a identificar se existe proporcionalidade ou viés constante.

### 7. **Erro Total (TE)**

   - Combina a precisão (variabilidade) e o viés em uma única métrica, útil para determinar a aceitabilidade dos métodos.

### 8. **Coeficiente de Determinação (R²)**

   - Explica a proporção da variância total nos dados que pode ser explicada pelo relacionamento entre os dois métodos.

### 9. **Teste T para Amostras Emparelhadas**

   - Pode ser usado para avaliar se há uma diferença significativa nas médias dos resultados entre os dois métodos.

### 10. **Intervalo de Confiança**

   - É importante calcular intervalos de confiança para os parâmetros, como a diferença média ou os coeficientes de regressão, para verificar a robustez das conclusões.

Esses parâmetros, quando usados em conjunto, fornecem uma análise abrangente para comparar métodos analíticos e determinar se eles podem ser usados de forma intercambiável.

E se os valores forem qualitativos e não quantitativos?

Quando se trata de **valores qualitativos** (em vez de quantitativos), a análise estatística para comparar dois métodos analíticos é diferente, pois não estamos lidando com números contínuos, mas com categorias ou classificações. Nesse caso, os parâmetros mais importantes são focados na **concordância entre categorias**. Aqui estão os principais parâmetros estatísticos a serem avaliados:

### 1. **Coeficiente Kappa de Cohen (κ)**

   - Mede a concordância entre dois métodos qualitativos além do que seria esperado pelo acaso. Um valor de Kappa igual a 1 indica concordância perfeita, enquanto 0 indica concordância equivalente ao acaso.

   - **Interpretação do Kappa**:

     - < 0: Concordância pior que o acaso.

     - 0 – 0.20: Concordância leve.

     - 0.21 – 0.40: Concordância razoável.

     - 0.41 – 0.60: Concordância moderada.

     - 0.61 – 0.80: Concordância substancial.

     - 0.81 – 1.00: Concordância quase perfeita.

### 2. **Coeficiente de Concordância de Gwet (AC1 ou AC2)**

   - Uma alternativa ao Kappa que corrige algumas limitações, especialmente quando a distribuição dos dados é desigual (categorias desbalanceadas). É mais robusto quando há muita concentração de valores em uma das categorias.

### 3. **Matriz de Confusão**

   - Mostra a distribuição de classificações entre os dois métodos. A matriz de confusão permite ver quantas vezes ambos os métodos concordaram em cada categoria e quantas vezes houve discordância.

   - Inclui métricas como **acurácia**, **sensibilidade (taxa de verdadeiros positivos)**, **especificidade (taxa de verdadeiros negativos)**, **valores preditivos positivo e negativo**.

### 4. **Sensibilidade e Especificidade**

   - **Sensibilidade**: Proporção de resultados verdadeiros positivos identificados corretamente por ambos os métodos.

   - **Especificidade**: Proporção de resultados verdadeiros negativos identificados corretamente por ambos os métodos.

   - Estes são úteis especialmente se o objetivo é detectar uma condição ou doença específica.

### 5. **Acurácia Global**

   - Mede a proporção total de casos em que os dois métodos concordam, considerando todos os casos (verdadeiros positivos e verdadeiros negativos).

### 6. **Análise de Concordância para Dados Ordinais**

   - Se os dados forem ordinais (com categorias em uma ordem hierárquica, como "baixo", "médio" e "alto"), pode ser usada uma extensão do Kappa, como o **Weighted Kappa** (Kappa ponderado), que leva em consideração o grau de discordância (por exemplo, a discordância entre "baixo" e "alto" é mais grave do que entre "baixo" e "médio").

### 7. **Teste de McNemar**

   - Usado para avaliar se há uma diferença significativa nas classificações entre dois métodos. É particularmente útil quando há dois resultados binários (ex.: "positivo" ou "negativo").

### 8. **Índice de Concordância Percentual**

   - Simplesmente a porcentagem de vezes que os dois métodos produzem a mesma classificação. Pode ser útil, mas ignora a possibilidade de concordância por acaso.

### 9. **Coeficiente de Correlação Intraclasse (ICC)**

   - Em alguns casos, especialmente com dados ordinais, o **ICC** pode ser utilizado para medir a consistência ou concordância entre medições feitas pelos dois métodos, mas geralmente é mais usado para dados quantitativos ou ordinais.

### 10. **Análise ROC (Receiver Operating Characteristic)**

   - Se os dados qualitativos representarem resultados binários (ex.: "positivo" ou "negativo"), a curva ROC pode ser usada para avaliar a capacidade discriminatória dos dois métodos. Isso pode fornecer métricas como a **área sob a curva (AUC)** para determinar o desempenho geral.

### Conclusão:

Para comparar métodos qualitativos, o **Kappa de Cohen**, **sensibilidade e especificidade**, e a **matriz de confusão** são os principais parâmetros. Dependendo da natureza dos dados (binários, ordinais, etc.), outras métricas como o **Weighted Kappa** ou o **Teste de McNemar** podem ser aplicáveis. Esses parâmetros ajudarão a determinar se os métodos produzem resultados consistentes e concordantes entre si.

Estas são as fórmulas matemáticas para as equações apresentadas:

Sensibilidade = VP / ( VP + FN )

Especificidade = VN / ( VN +  FP )

VPP = VP / ( VP + FP )

VPN = VN / ( VN + FN )

Acuraria = ( VP + VN )/ ( VP + VN + FP + FN )

K = ( Po - Pc ) / ( 1 - Pc)

LR+ = Sensibilidade / ( 1 - Especificidade )

LR- = ( 1 - Sensibilidade ) / Especificidade

Colheita de sangue medular para mielograma

 Colheita de sangue medular para mielograma

Um mielograma não deve ser feito com sangue medular usando citrato de sódio como anticoagulante por várias razões:

Diluição da Amostra: O citrato de sódio dilui a amostra de sangue medular, o que pode alterar a concentração de células e dificultar a interpretação correta dos resultados. Isso pode levar a uma subestimação ou superestimação de certos tipos de células.

Alteração Morfológica: O citrato de sódio pode causar alterações morfológicas nas células, dificultando a identificação e a avaliação precisa das diferentes linhagens celulares. Isso é especialmente crítico em diagnósticos que dependem da morfologia celular, como leucemias e outras doenças hematológicas.

Interferência com Corantes: O citrato de sódio pode interferir com os corantes utilizados na coloração das lâminas, comprometendo a qualidade das preparações citológicas e, consequentemente, a interpretação microscópica.

Preferência por EDTA: O anticoagulante preferido para a coleta de amostras de medula óssea é geralmente o EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético), que preserva melhor a morfologia celular e não dilui a amostra. O EDTA é mais adequado para manter a integridade das células e garantir resultados mais precisos.

Portanto, para um mielograma preciso e confiável, é fundamental utilizar medula óssea fresca, preferencialmente sem anticoagulantes ou com EDTA, para evitar as complicações mencionadas acima.

Anomalía de May-Hegglin

Anomalía de May-Hegglin 

A anomalia de May-Hegglin é uma doença hereditária rara que afeta o sangue e que se caracteriza pela presença de trombocitopenia (baixo número de plaquetas), plaquetas anormalmente grandes e presença de corpos de Döhle nos leucócitos (um tipo de glóbulos brancos). A seguir são descritas as suas principais características e aspetos relevantes:

Principais características

1. Trombocitopenia:

- Diminuição do número de plaquetas no sangue, o que pode levar a um risco acrescido de hemorragia.

2. Plaquetas Gigantes:

- As plaquetas são maiores do que o normal, o que pode ser observado através de uma análise ao sangue.

3. Corpos Döhle:

- Inclusões citoplasmáticas azuladas nos neutrófilos, visíveis ao microscópio.

Sintomas

Os sintomas podem variar em gravidade e podem incluir:

- Hemorragia nasal.

- Fácil formação de hematomas.

- Hemorragia prolongada de feridas.

- Em casos graves, pode haver hemorragia interna.

Diagnóstico

O diagnóstico da anomalia de May-Hegglin baseia-se em:

- História clínica e exame físico.

- Exames laboratoriais, especialmente hemograma completo e exame microscópico de uma amostra de sangue para identificação de características plaquetárias e corpos de Döhle.

Tratamento

Não existe cura específica para esta anomalia. A gestão centra-se em:

- Monitorização regular dos níveis de plaquetas.

- Tratamento sintomático para controlar episódios hemorrágicos.

- Em casos graves, podem ser consideradas transfusões de plaquetas.

Genética

A anomalia de May-Hegglin é uma condição autossómica dominante, o que significa que uma única cópia do gene alterado é suficiente para uma pessoa desenvolver a perturbação. Está associada a mutações no gene MYH9, que codifica a cadeia pesada da miosina não muscular tipo IIA.

Em resumo, a anomalia de May-Hegglin é uma doença hereditária do sangue caracterizada por trombocitopenia, plaquetas gigantes e corpos de Döhle nos neutrófilos. A sua gestão é sobretudo sintomática e de suporte, sendo o diagnóstico feito através de análises sanguíneas específicas.

Técnicas laboratoriais de estudo e doseamento de microRNA

 

Técnicas laboratoriais de estudo e doseamento de microRNA

O estudo e doseamento de microRNAs (miRNAs) no laboratório envolvem várias técnicas sofisticadas. Os miRNAs são pequenas moléculas de RNA não codificante que regulam a expressão gênica, e sua quantificação precisa é crucial para pesquisas em biologia molecular, diagnósticos e desenvolvimento de terapias. Aqui estão algumas das principais técnicas utilizadas:

1. Extração de miRNA:

- Kit de Extração de RNA Total: Kits comerciais, como o TRIzol ou os kits de colunas de sílica, são usados para isolar o RNA total, incluindo os miRNAs, de amostras biológicas.

- Extração Específica para miRNA: Kits específicos que enriquecem a fração de miRNA, eliminando moléculas de RNA maiores.

2. Quantificação e Avaliação de Qualidade:

- Espectrofotometria (Nanodrop): Para avaliar a concentração de RNA e sua pureza.

- Bioanalisador (Agilent Bioanalyzer ou similar): Avalia a integridade do RNA e quantifica as frações de miRNA.

3. Técnicas de Quantificação de miRNA:

- qRT-PCR (Reverse Transcription Quantitative PCR):

- Uma das técnicas mais comuns para quantificar miRNAs.

- Envolve a conversão dos miRNAs em cDNA utilizando uma transcriptase reversa, seguida de amplificação quantitativa.

- Utiliza primers específicos para cada miRNA ou uma abordagem universal com um primer específico para o miRNA e um primer universal para a cauda adicionada durante a transcrição reversa.

- Northern Blotting:

- Técnica tradicional para a detecção de miRNAs, onde o RNA é separado por eletroforese e hibridizado com sondas marcadas específicas para o miRNA de interesse.

- Menos sensível e mais laboriosa, mas útil para validação de resultados.

- Sequenciamento de RNA (RNA-Seq):

- Oferece um perfil abrangente de miRNAs, permitindo a detecção de novos miRNAs.

- Envolve a construção de bibliotecas de cDNA a partir dos miRNAs e sequenciamento em plataformas de alta capacidade (como Illumina).

- Requer análise bioinformática para quantificação e identificação dos miRNAs.

- Microarray de miRNA:

- Utiliza sondas específicas para miRNAs conhecidas imobilizadas em um chip.

- Permite a quantificação de múltiplos miRNAs simultaneamente.

- Menos sensível que qRT-PCR, mas útil para perfis de expressão de larga escala.

- Digital PCR (dPCR):

- Uma técnica avançada para quantificação absoluta de miRNAs.

- Divide a amostra em milhares de pequenas reações para amplificação individual, permitindo a quantificação exata das cópias de miRNA.

- Hibridização in situ (ISH):

- Permite a localização espacial de miRNAs dentro de células ou tecidos, usando sondas de oligonucleotídeos marcadas.

- Útil para estudos de expressão tecidual.

4. Validação Funcional:

- Knockdown ou Overexpressão de miRNA:

- Usado para investigar o papel funcional dos miRNAs.

- Pode ser realizado utilizando inibidores de miRNA (antagomirs) ou miméticos de miRNA.

Considerações Finais:

A escolha da técnica depende do objetivo do estudo, da quantidade e da qualidade da amostra disponível, da necessidade de quantificação absoluta ou relativa, e dos recursos laboratoriais. A combinação de diferentes métodos pode ser necessária para confirmar resultados e obter uma compreensão abrangente dos miRNAs em estudo.

Comparação entre calprotetina fecal, miRNA e mtDNA como marcadores na Doença de Crohn

Comparação entre calprotetina fecal, miRNA e mtDNA como marcadores na Doença de Crohn 

O diagnóstico e o acompanhamento da Doença de Crohn são desafiadores e requerem biomarcadores precisos para avaliar a atividade e a progressão da doença. Tanto o microRNA (miRNA) quanto a calprotectina são utilizados como biomarcadores, mas cada um tem suas vantagens específicas. Vamos explorar as vantagens do uso de miRNAs em comparação com a calprotectina no diagnóstico precoce e no acompanhamento da Doença de Crohn:

Vantagens do microRNA no diagnóstico precoce e follow-up da Doença de Crohn:

1. Diagnóstico Precoce e Sensibilidade: Os miRNAs têm mostrado potencial para detecção precoce da Doença de Crohn antes que sintomas clínicos se tornem evidentes. Eles podem detectar alterações moleculares nos estágios iniciais da doença, oferecendo uma vantagem sobre a calprotectina, que é mais indicativa de inflamação já estabelecida.

2. Especificidade para Subtipos de Doença: Diferentes miRNAs podem estar associados a subtipos específicos da Doença de Crohn, permitindo uma caracterização mais detalhada do fenótipo da doença. Isso pode ajudar na personalização do tratamento e no manejo da doença de acordo com o perfil molecular do paciente.

3. Menor Invasividade: Os miRNAs podem ser detectados em fluidos corporais, como sangue, saliva e urina, tornando o processo de coleta menos invasivo em comparação com a necessidade de fezes para a medição da calprotectina.

4. Monitoramento da Resposta ao Tratamento: Os níveis de miRNAs podem refletir mudanças na atividade da doença e responder mais rapidamente ao tratamento do que a calprotectina, que pode demorar a mostrar alterações nos níveis após intervenções terapêuticas.

5. Previsão de Recorrências: Alguns miRNAs têm potencial para prever flares ou recidivas da Doença de Crohn, proporcionando uma ferramenta valiosa para o acompanhamento a longo prazo e a modulação do tratamento antes que ocorra um agravamento clínico.

6. Correlação com Processos Patológicos Específicos: Os miRNAs estão diretamente envolvidos na regulação da expressão gênica e em processos patológicos fundamentais, como inflamação e resposta imune, o que pode oferecer insights mais precisos sobre os mecanismos da doença em comparação com biomarcadores inflamatórios como a calprotectina.

Comparação com Calprotectina:

- Calprotectina é um marcador de inflamação intestinal derivado de neutrófilos, amplamente usado para avaliar a atividade inflamatória na Doença de Crohn. Embora seja útil e não invasiva, sua principal limitação é a falta de especificidade para diferentes tipos de inflamação intestinal e a possível variação nos resultados devido a outras condições inflamatórias ou infecciosas.

- MicroRNAs, por outro lado, oferecem um perfil molecular mais detalhado, são menos suscetíveis a variações por outras inflamações inespecíficas e podem fornecer informações sobre a expressão gênica que vai além do simples estado inflamatório.

Conclusão:

Enquanto a calprotectina continua sendo uma ferramenta importante para o diagnóstico e acompanhamento da Doença de Crohn devido à sua facilidade de uso e ampla disponibilidade, os miRNAs representam uma alternativa promissora com potencial para diagnósticos mais precoces, especificidade melhorada, e um acompanhamento mais detalhado da doença. A integração de miRNAs no manejo clínico da Doença de Crohn pode levar a uma medicina mais personalizada e a um controle mais eficaz da doença.

Para o diagnóstico precoce e acompanhamento da Doença de Crohn, o DNA mitocondrial, microRNA (miRNA) e calprotectina oferecem diferentes vantagens e têm limitações específicas. Vamos comparar esses três biomarcadores para entender melhor como eles se aplicam ao diagnóstico precoce e ao acompanhamento da Doença de Crohn:

1. DNA Mitocondrial (mtDNA)

Vantagens:

- Marcador de Estresse Celular e Inflamação: O DNA mitocondrial livre no sangue pode ser um indicador de estresse celular e inflamação, que são características comuns na Doença de Crohn.

- Sensibilidade à Disfunção Mitocondrial: O mtDNA pode refletir disfunções mitocondriais associadas a processos inflamatórios crônicos, proporcionando uma visão sobre alterações metabólicas e inflamatórias que ocorrem precocemente.

- Potencial para Diagnóstico Precoce: Pode ser útil para identificar respostas imunes desreguladas antes que a inflamação se torne evidente clinicamente.

Desvantagens:

- Especificidade Limitada: O mtDNA elevado pode ocorrer em várias condições inflamatórias e infecciosas, não sendo específico para a Doença de Crohn.

- Correlação Variável com a Atividade da Doença: A correlação entre os níveis de mtDNA e a atividade da Doença de Crohn pode não ser consistente, limitando sua utilidade no acompanhamento da progressão da doença.

2. microRNA (miRNA)

Vantagens:

- Diagnóstico Precoce e Alta Sensibilidade: Os miRNAs podem detectar mudanças moleculares iniciais associadas à Doença de Crohn, possibilitando um diagnóstico precoce.

- Especificidade para a Doença: Certos miRNAs estão associados a padrões específicos de expressão na Doença de Crohn, o que pode ajudar na distinção de outras doenças inflamatórias intestinais.

- Versatilidade no Follow-up: Podem ser utilizados para monitorar a resposta ao tratamento e prever recidivas, oferecendo um acompanhamento dinâmico da doença.

- Menos Invasivo: Podem ser detectados em amostras de sangue, saliva ou outros fluidos corporais.

Desvantagens:

- Complexidade na Análise: A interpretação dos perfis de miRNA pode ser complexa, exigindo tecnologia avançada e padronização para aplicação clínica ampla.

- Custo Elevado: A análise de miRNAs pode ser mais cara em comparação com biomarcadores mais estabelecidos como a calprotectina.

3. Calprotectina

Vantagens:

- Facilidade de Uso e Disponibilidade: A calprotectina fecal é um biomarcador amplamente usado e de fácil acesso, com protocolos bem estabelecidos para monitorar inflamação intestinal.

- Boa Correlação com Inflamação Intestinal: É um marcador direto de inflamação intestinal, útil tanto para o diagnóstico quanto para o acompanhamento da atividade da Doença de Crohn.

- Custo-efetivo: É relativamente barata e de fácil realização, sendo uma escolha comum para monitoramento de pacientes.

Desvantagens:

- Especificidade Limitada para a Doença de Crohn: A calprotectina pode estar elevada em várias condições inflamatórias intestinais, como a colite ulcerativa e infecções intestinais.

- Menor Sensibilidade para Diagnóstico Precoce: Geralmente reflete inflamação ativa, e pode não ser útil para detectar a doença nos estágios muito iniciais, antes da inflamação significativa.

- Variabilidade nos Resultados: Os níveis de calprotectina podem ser influenciados por fatores dietéticos, medicamentosos e outras condições inflamatórias.

Comparação Resumida

Conclusão

Cada biomarcador tem suas vantagens específicas, e a escolha ideal pode depender do contexto clínico e dos recursos disponíveis. Os miRNAs oferecem alta sensibilidade e especificidade para o diagnóstico precoce e acompanhamento personalizado, mas com maior custo e complexidade analítica. O DNA mitocondrial pode fornecer insights sobre estresse celular precoce, mas com limitações de especificidade. A calprotectina continua sendo uma ferramenta prática e amplamente aceita para monitoramento da inflamação, mas com limitações para diagnóstico precoce e especificidade da doença.

Uma abordagem integrada que combine diferentes biomarcadores pode proporcionar uma avaliação mais completa e personalizada da Doença de Crohn.