Contagem diferencial de esfregaço do sangue periférico

Como fazer uma contagem diferencial leucocitária num esfregaço de sangue periférico?

Quando estamos a fazer essa análise ao microscópio, a escolha do local certo no esfregaço é crucial. A franja do esfregaço, também conhecida como a "zona de franja" ou "feathered edge", é onde os leucócitos tendem a acumular-se de forma desigual. Nesta zona, os leucócitos podem estar distorcidos ou sobrepostos, o que pode levar a erros na contagem e identificação dos diferentes tipos de células.

A melhor área para realizar a contagem diferencial é a chamada "zona de leitura", que é uma região mais central do esfregaço onde as células estão distribuídas de forma uniforme, permitindo uma observação clara e precisa das características morfológicas de cada tipo de leucócito. Assim, consegues uma contagem mais fiável e representativa do estado hematológico do paciente. 

Na franja do esfregaço, existe uma tendência para que as células maiores, como os neutrófilos, sejam mais arrastadas para essa zona devido ao seu tamanho e peso. Durante o processo de preparação do esfregaço, as forças físicas em jogo podem levar à distribuição desigual das células, com os neutrófilos a acumularem-se mais na franja. Os linfócitos, sendo geralmente menores, não são tão suscetíveis a este arrastamento.

Esta distribuição desigual pode resultar numa contagem diferencial que não reflete com precisão a proporção real dos diferentes tipos de leucócitos no sangue. Portanto, é mais seguro e preciso realizar a contagem na zona de leitura, onde as células estão distribuídas de forma mais uniforme. Assim, garantimos que a análise seja o mais fiel possível à realidade do paciente. 

As células imaturas, como os blastos, que tendem a ser maiores, podem também ser arrastadas para a franja do esfregaço durante a preparação. Tal como acontece com os neutrófilos, essa acumulação pode levar a uma sobre-representação dos blastos se a contagem for feita nessa área.

Portanto, ao realizar a contagem diferencial na zona de leitura, onde as células estão mais uniformemente distribuídas, evitamos essa distorção e conseguimos uma avaliação mais precisa da presença e quantidade de blastos no sangue. Esta precisão é particularmente importante em contextos como a avaliação de leucemias, onde a contagem de blastos pode ter implicações diagnósticas significativas. 

É possível que a citometria de fluxo apresente um resultado falso de presença exagerada de blastos em circulação. A citometria de fluxo é uma técnica poderosa e precisa para analisar características celulares, mas não está isenta de erros. Algumas razões para resultados falsos incluem:

Interferência técnica: Problemas na preparação da amostra, como a lise inadequada de eritrócitos ou a presença de detritos celulares, podem interferir na análise e levar a contagens erradas.

Expressão antigénica atípica: Algumas células normais ou reativas podem expressar antigénios semelhantes aos dos blastos, levando a uma interpretação errada pela citometria de fluxo.

Erros de gating: O processo de "gating", que é usado para definir populações celulares específicas com base em características como tamanho e complexidade, pode ser impreciso, especialmente em amostras complexas ou com populações celulares sobrepostas.

Contaminação: A presença de células de outra origem, como células progenitoras de medula óssea em amostras de sangue periférico, pode ser interpretada erroneamente como blastos.

Por estas razões, é importante correlacionar os resultados da citometria de fluxo com outros achados clínicos e laboratoriais, como o exame morfológico do esfregaço de sangue periférico e a história clínica do paciente, para garantir um diagnóstico preciso. 

Bacteriofagos: modo de actuação e medicamentos que os utilizam

 Bacteriofagos: modo de actuação e medicamentos que os utilizam

Os bacteriófagos, ou simplesmente fagos, são vírus que infectam exclusivamente bactérias. Eles desempenham um papel importante tanto na ecologia microbiana quanto em aplicações biotecnológicas e médicas. Aqui estão os principais pontos sobre eles:

Estrutura

• Material genético: Os fagos podem conter DNA ou RNA, que pode ser de fita simples ou dupla.

• Cabeça (capsídeo): Protege o material genético, normalmente com formato icosaédrico.

• Cauda: Em muitos casos, possui uma estrutura tubular que ajuda a injetar o material genético na bactéria hospedeira.

Ciclo de vida

Os bacteriófagos podem seguir dois ciclos principais:

1. Ciclo lítico:

• O fago infecta a bactéria e usa a maquinaria celular para replicar seu material genético e produzir novos vírus.

• A célula bacteriana é destruída (lisada) ao libertar os novos fagos.

2. Ciclo lisogênico:

• O material genético do fago é integrado ao DNA da bactéria e pode permanecer inativo (como um profago), sendo replicado junto com o genoma bacteriano.

• Sob certas condições, o ciclo lisogênico pode se converter em lítico.

Importância

1. Ecologia:

• Controlam populações bacterianas em ecossistemas naturais e industriais.

• Influenciam o equilíbrio dos microbiomas, como o intestinal.

2. Medicina:

• Usados na terapia fágica, uma alternativa aos antibióticos para tratar infecções bacterianas resistentes.

• Estudados para aplicações em diagnóstico e entrega de medicamentos.

3. Pesquisa científica:

• Foram cruciais no entendimento de processos biológicos, como a replicação do DNA e a expressão gênica (experimentos de Hershey e Chase com o fago T2).

4. Indústria alimentícia:

• Utilizados para controlar bactérias patogênicas em alimentos e como bioindicadores.

Os bacteriófagos têm grande potencial para lidar com o aumento da resistência bacteriana, destacando-se como uma ferramenta promissora no combate a infecções.

Os fagoterápicos (remédios baseados em bacteriófagos) são usados principalmente em países como Rússia, Geórgia e Polônia, onde essa abordagem tem sido explorada há décadas. Alguns produtos notáveis incluem:

Exemplos de medicamentos e seus alvos:

1. Pyophage

• Bactérias alvo: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus spp., Enterococcus spp.

• Uso: Infecções de pele, feridas, queimaduras, infecções intestinais e urinárias.

2. Intestiphage

• Bactérias alvo: E. coli, Shigella spp., Salmonella spp.

• Uso: Tratamento de infecções intestinais, como diarreia e disbiose.

3. Staphylophage

• Bactérias alvo: Staphylococcus aureus (incluindo MRSA, resistente à meticilina).

• Uso: Infecções causadas por estafilococos, como furúnculos, abscessos e septicemia.

4. Sextaphage

• Bactérias alvo: E. coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus spp., Streptococcus spp.

• Uso: Infecções multirresistentes, incluindo infecções urinárias e respiratórias.

5. PyoBacteriophage

• Bactérias alvo: Várias bactérias piógenas (produtoras de pus), incluindo Proteus e Klebsiella.

• Uso: Infecções de feridas e tecidos moles.

Disponibilidade e uso

• Geórgia: O Instituto Eliava, em Tbilisi, é uma das instituições pioneiras na pesquisa e produção de fagos para uso terapêutico.

• Europa Ocidental e EUA: Há pesquisas avançadas, mas o uso ainda é limitado a casos experimentais ou situações emergenciais devido a questões regulatórias.

Importância no combate à resistência bacteriana

Esses medicamentos estão sendo revistos globalmente como alternativas aos antibióticos, especialmente para tratar infecções causadas por bactérias multirresistentes. O uso personalizado de coquetéis de fagos (que combinam múltiplos vírus para atacar diferentes alvos) é uma estratégia comum.

Produtos como o Intestiphage e outros medicamentos fágicos são, na verdade, coquetéis de diferentes bacteriófagos, cada um projetado para atacar uma bactéria específica dentro de um grupo alvo. Essa abordagem é necessária devido à alta especificidade dos fagos, que geralmente infectam apenas determinadas cepas ou espécies de bactérias.

Por que usar coquetéis de fagos?

1. Cobertura ampla: Cada fago no coqueteil é escolhido para atacar uma bactéria específica. Juntos, eles ampliam o espectro de ação do medicamento, cobrindo várias espécies ou cepas de interesse.

2. Prevenção de resistência: O uso de múltiplos fagos reduz o risco de uma bactéria desenvolver resistência, pois seria necessário escapar simultaneamente de todos os fagos no coquetel.

3. Eficácia contra populações bacterianas mistas: Muitas infecções envolvem mais de uma espécie bacteriana (infecções polimicrobianas), o que exige a presença de diferentes fagos para atacar cada patógeno.

Como é feito o coqueteil?

1. Seleção de fagos: São escolhidos fagos que demonstram alta eficácia contra bactérias-alvo comuns em infecções específicas.

• Por exemplo, no caso do Intestiphage, os fagos incluídos são específicos para E. coli, Shigella spp., Salmonella spp., entre outros.

2. Teste e ajuste: O coqueteil pode ser personalizado com base na resistência da bactéria no paciente. Em muitos casos, o laboratório faz um teste prévio para identificar quais fagos são mais eficazes contra a cepa da bactéria causadora da infecção.

Vantagens dos coquetéis de fagos

• Podem ser usados em tratamentos empíricos (quando a bactéria causadora ainda não foi identificada com precisão).

• Adaptáveis: O coqueteil pode ser ajustado ou substituído se a bactéria desenvolver resistência a um dos fagos.

• Maior eficácia em infecções complexas.

Em resumo, os coquetéis de fagos como o Intestiphage combinam vários vírus para atacar diferentes espécies bacterianas, tornando-os versáteis e eficazes contra um espectro mais amplo de patógenos.

A capacidade de um medicamento de fagoterapia combater todas as espécies de Salmonella spp.depende da especificidade dos bacteriófagos usados no tratamento. Aqui está como funciona:

1. Especificidade dos fagos

Os bacteriófagos geralmente possuem uma especificidade muito alta, podendo infectar:

• Uma espécie bacteriana específica (e.g., Salmonella enterica).

• Apenas algumas cepas dentro de uma espécie (e.g., apenas certas variantes de Salmonella enterica sorovar Typhimurium).

• Um gênero bacteriano mais amplo, se as bactérias compartilham características-alvo semelhantes.

Assim, para cobrir todas as espécies ou sorovares de Salmonella, o medicamento geralmente é um coqueteil de fagos, onde:

• Cada fago é escolhido para atacar um grupo de espécies ou sorovares.

• Fagos adicionais são incluídos para aumentar a cobertura caso surjam variantes resistentes.

2. É possível um único fago atacar todas as Salmonella spp.?

• Raramente. Alguns fagos apresentam um espectro de ação mais amplo e podem infectar múltiplos sorovares de Salmonella. Isso ocorre se essas bactérias compartilharem receptores-alvo comuns, como proteínas na membrana celular ou estruturas específicas.

• No entanto, é improvável que um único fago consiga cobrir todas as espécies e variantes, pois diferenças entre sorovares podem impedir a ligação do fago a receptores específicos.

3. Estratégia comum para Salmonella spp.

Para tratar infecções causadas por Salmonella spp., os medicamentos fágicos geralmente:

• Incluem um coqueteil de vários fagos, cada um direcionado a diferentes sorovares ou cepas.

• São ajustados ou personalizados em casos específicos, baseando-se em testes de laboratório para identificar quais fagos são eficazes contra a variante de Salmonella presente no paciente.

Por exemplo:

• Uma combinação de fagos pode ser eficaz contra S. Typhi (causadora de febre tifoide), S. Typhimurium (causadora de gastroenterite), e outras variantes.

Resumo

Um medicamento fágico para Salmonella spp. geralmente é um coqueteil de múltiplos fagos, cada um altamente específico para diferentes espécies ou variantes. Isso é necessário porque a alta especificidade dos fagos impede que um único fago seja eficaz contra todas as variantes de Salmonella. Contudo, se houver fagos de espectro mais amplo, eles podem ser incluídos para cobrir múltiplos sorovares ao mesmo tempo.

NOTA: Um sorovar, também conhecido como serovar, é uma variante dentro de uma espécie de microorganismo que é distinguida com base nas suas propriedades antigénicas. Basicamente, é uma forma de classificar bactérias, vírus ou outros microorganismos com base nas diferenças nos seus antígenos de superfície.

Esta classificação é especialmente útil em microbiologia para identificar e diferenciar estirpes de patógenos que podem ter diferentes características epidemiológicas ou patogénicas. Por exemplo, no caso da bactéria Salmonella, existem muitos sorovares diferentes, cada um com diferentes capacidades de causar doença em humanos ou animais.

Os sorovares são identificados através de testes serológicos que detectam a presença de antígenos específicos na superfície do microorganismo, permitindo uma identificação mais precisa e ajudando no rastreamento de surtos e no desenvolvimento de estratégias de controlo de doenças. 

Técnica citoquimica para avaliação da fosfatase alcalina leucocitária

 Fosfatase alcalina leucocitária

A coloração da fosfatase alcalina leucocitaria não pode ser executada em sangue com anticoagulante, nomeadamente EDTA e sim deve ser feita a partir dum esfregaço de sangue periférico colhido directamente do dedo?

A coloração da fosfatase alcalina leucocitária (FAL) é uma técnica utilizada para avaliar a atividade enzimática nos leucócitos, especialmente nos neutrófilos. Esta coloração é sensível a alguns tipos de anticoagulantes, como o EDTA, que podem inibir a atividade enzimática e, portanto, interferir nos resultados.

Por esta razão, é preferível realizar a coloração da FAL em esfregaços de sangue periférico colhidos diretamente do dedo, onde o sangue não foi tratado com anticoagulante. Este método permite uma avaliação mais precisa da atividade enzimática nos leucócitos.

Portanto, para obter resultados mais fiáveis, é aconselhável utilizar sangue fresco, sem anticoagulante, para a coloração da fosfatase alcalina leucocitária. 🩸🔍

O que acontece à fosfatase alcalina leucocitaria quando feita a partir de sangue colhido para tubo de EDTA?

Quando a coloração da fosfatase alcalina leucocitária (FAL) é realizada em sangue colhido num tubo com EDTA, a atividade enzimática pode ser inibida. O EDTA é um anticoagulante que quelata o cálcio e outros metais necessários para a atividade enzimática, incluindo a da fosfatase alcalina. Como resultado, a coloração pode mostrar uma atividade reduzida ou mesmo ausente, levando a resultados falsamente baixos.

Por isso, para uma avaliação precisa da FAL, é preferível utilizar sangue fresco colhido sem anticoagulantes, como em esfregaços de sangue periférico colhidos diretamente do dedo. Desta forma, evita-se a interferência do EDTA e obtêm-se resultados mais fiáveis.

Parâmetros estatísticos usados para comparação de 2 métodos analíticos

 Quais os principais parâmetros analíticos a usar numa comparação entre 2 métodos de análise?

Quais os parâmetros estatísticos mais importantes a serem avaliados quando se pretende fazer a comparação entre 2 métodos analiticos?

Ao comparar dois métodos analíticos, é essencial avaliar diferentes parâmetros estatísticos para determinar a precisão, exatidão e concordância entre os métodos. Os principais parâmetros a serem considerados incluem:

### 1. **Viés (Bias)**

   - Mede a diferença sistemática entre as médias dos dois métodos. Se um método é consistentemente maior ou menor do que o outro, há um viés.

   

### 2. **Precisão (Reprodutibilidade ou Repetibilidade)**

   - Avalia a variação nos resultados quando o mesmo método é repetido sob as mesmas condições. Isso pode ser medido usando o **desvio padrão (SD)** ou o **coeficiente de variação (CV)**.

### 3. **Exatidão**

   - Mede o quão próximo os resultados de ambos os métodos estão de um valor de referência ou padrão aceito.

### 4. **Correlação de Pearson (r)**

   - Indica o grau de associação linear entre os dois métodos. Valores próximos de 1 indicam forte correlação, mas **não garante concordância**, apenas associação.

### 5. **Teste de Bland-Altman (Plot de Diferença)**

   - Avalia a concordância entre os dois métodos, analisando a diferença entre eles em função da média. Este método é preferido para entender a diferença sistemática e os limites de concordância entre dois métodos.

### 6. **Regressão Linear (Deming ou Passing-Bablok)**

   - A **regressão Deming** ou **Passing-Bablok** são adequadas quando há erros em ambos os métodos. A equação da reta de regressão (inclinação e intercepto) ajuda a identificar se existe proporcionalidade ou viés constante.

### 7. **Erro Total (TE)**

   - Combina a precisão (variabilidade) e o viés em uma única métrica, útil para determinar a aceitabilidade dos métodos.

### 8. **Coeficiente de Determinação (R²)**

   - Explica a proporção da variância total nos dados que pode ser explicada pelo relacionamento entre os dois métodos.

### 9. **Teste T para Amostras Emparelhadas**

   - Pode ser usado para avaliar se há uma diferença significativa nas médias dos resultados entre os dois métodos.

### 10. **Intervalo de Confiança**

   - É importante calcular intervalos de confiança para os parâmetros, como a diferença média ou os coeficientes de regressão, para verificar a robustez das conclusões.

Esses parâmetros, quando usados em conjunto, fornecem uma análise abrangente para comparar métodos analíticos e determinar se eles podem ser usados de forma intercambiável.

E se os valores forem qualitativos e não quantitativos?

Quando se trata de **valores qualitativos** (em vez de quantitativos), a análise estatística para comparar dois métodos analíticos é diferente, pois não estamos lidando com números contínuos, mas com categorias ou classificações. Nesse caso, os parâmetros mais importantes são focados na **concordância entre categorias**. Aqui estão os principais parâmetros estatísticos a serem avaliados:

### 1. **Coeficiente Kappa de Cohen (κ)**

   - Mede a concordância entre dois métodos qualitativos além do que seria esperado pelo acaso. Um valor de Kappa igual a 1 indica concordância perfeita, enquanto 0 indica concordância equivalente ao acaso.

   - **Interpretação do Kappa**:

     - < 0: Concordância pior que o acaso.

     - 0 – 0.20: Concordância leve.

     - 0.21 – 0.40: Concordância razoável.

     - 0.41 – 0.60: Concordância moderada.

     - 0.61 – 0.80: Concordância substancial.

     - 0.81 – 1.00: Concordância quase perfeita.

### 2. **Coeficiente de Concordância de Gwet (AC1 ou AC2)**

   - Uma alternativa ao Kappa que corrige algumas limitações, especialmente quando a distribuição dos dados é desigual (categorias desbalanceadas). É mais robusto quando há muita concentração de valores em uma das categorias.

### 3. **Matriz de Confusão**

   - Mostra a distribuição de classificações entre os dois métodos. A matriz de confusão permite ver quantas vezes ambos os métodos concordaram em cada categoria e quantas vezes houve discordância.

   - Inclui métricas como **acurácia**, **sensibilidade (taxa de verdadeiros positivos)**, **especificidade (taxa de verdadeiros negativos)**, **valores preditivos positivo e negativo**.

### 4. **Sensibilidade e Especificidade**

   - **Sensibilidade**: Proporção de resultados verdadeiros positivos identificados corretamente por ambos os métodos.

   - **Especificidade**: Proporção de resultados verdadeiros negativos identificados corretamente por ambos os métodos.

   - Estes são úteis especialmente se o objetivo é detectar uma condição ou doença específica.

### 5. **Acurácia Global**

   - Mede a proporção total de casos em que os dois métodos concordam, considerando todos os casos (verdadeiros positivos e verdadeiros negativos).

### 6. **Análise de Concordância para Dados Ordinais**

   - Se os dados forem ordinais (com categorias em uma ordem hierárquica, como "baixo", "médio" e "alto"), pode ser usada uma extensão do Kappa, como o **Weighted Kappa** (Kappa ponderado), que leva em consideração o grau de discordância (por exemplo, a discordância entre "baixo" e "alto" é mais grave do que entre "baixo" e "médio").

### 7. **Teste de McNemar**

   - Usado para avaliar se há uma diferença significativa nas classificações entre dois métodos. É particularmente útil quando há dois resultados binários (ex.: "positivo" ou "negativo").

### 8. **Índice de Concordância Percentual**

   - Simplesmente a porcentagem de vezes que os dois métodos produzem a mesma classificação. Pode ser útil, mas ignora a possibilidade de concordância por acaso.

### 9. **Coeficiente de Correlação Intraclasse (ICC)**

   - Em alguns casos, especialmente com dados ordinais, o **ICC** pode ser utilizado para medir a consistência ou concordância entre medições feitas pelos dois métodos, mas geralmente é mais usado para dados quantitativos ou ordinais.

### 10. **Análise ROC (Receiver Operating Characteristic)**

   - Se os dados qualitativos representarem resultados binários (ex.: "positivo" ou "negativo"), a curva ROC pode ser usada para avaliar a capacidade discriminatória dos dois métodos. Isso pode fornecer métricas como a **área sob a curva (AUC)** para determinar o desempenho geral.

### Conclusão:

Para comparar métodos qualitativos, o **Kappa de Cohen**, **sensibilidade e especificidade**, e a **matriz de confusão** são os principais parâmetros. Dependendo da natureza dos dados (binários, ordinais, etc.), outras métricas como o **Weighted Kappa** ou o **Teste de McNemar** podem ser aplicáveis. Esses parâmetros ajudarão a determinar se os métodos produzem resultados consistentes e concordantes entre si.

Estas são as fórmulas matemáticas para as equações apresentadas:

Sensibilidade = VP / ( VP + FN )

Especificidade = VN / ( VN +  FP )

VPP = VP / ( VP + FP )

VPN = VN / ( VN + FN )

Acuraria = ( VP + VN )/ ( VP + VN + FP + FN )

K = ( Po - Pc ) / ( 1 - Pc)

LR+ = Sensibilidade / ( 1 - Especificidade )

LR- = ( 1 - Sensibilidade ) / Especificidade