Técnicas laboratoriais de estudo e doseamento de microRNA

 

Técnicas laboratoriais de estudo e doseamento de microRNA

O estudo e doseamento de microRNAs (miRNAs) no laboratório envolvem várias técnicas sofisticadas. Os miRNAs são pequenas moléculas de RNA não codificante que regulam a expressão gênica, e sua quantificação precisa é crucial para pesquisas em biologia molecular, diagnósticos e desenvolvimento de terapias. Aqui estão algumas das principais técnicas utilizadas:

1. Extração de miRNA:

- Kit de Extração de RNA Total: Kits comerciais, como o TRIzol ou os kits de colunas de sílica, são usados para isolar o RNA total, incluindo os miRNAs, de amostras biológicas.

- Extração Específica para miRNA: Kits específicos que enriquecem a fração de miRNA, eliminando moléculas de RNA maiores.

2. Quantificação e Avaliação de Qualidade:

- Espectrofotometria (Nanodrop): Para avaliar a concentração de RNA e sua pureza.

- Bioanalisador (Agilent Bioanalyzer ou similar): Avalia a integridade do RNA e quantifica as frações de miRNA.

3. Técnicas de Quantificação de miRNA:

- qRT-PCR (Reverse Transcription Quantitative PCR):

- Uma das técnicas mais comuns para quantificar miRNAs.

- Envolve a conversão dos miRNAs em cDNA utilizando uma transcriptase reversa, seguida de amplificação quantitativa.

- Utiliza primers específicos para cada miRNA ou uma abordagem universal com um primer específico para o miRNA e um primer universal para a cauda adicionada durante a transcrição reversa.

- Northern Blotting:

- Técnica tradicional para a detecção de miRNAs, onde o RNA é separado por eletroforese e hibridizado com sondas marcadas específicas para o miRNA de interesse.

- Menos sensível e mais laboriosa, mas útil para validação de resultados.

- Sequenciamento de RNA (RNA-Seq):

- Oferece um perfil abrangente de miRNAs, permitindo a detecção de novos miRNAs.

- Envolve a construção de bibliotecas de cDNA a partir dos miRNAs e sequenciamento em plataformas de alta capacidade (como Illumina).

- Requer análise bioinformática para quantificação e identificação dos miRNAs.

- Microarray de miRNA:

- Utiliza sondas específicas para miRNAs conhecidas imobilizadas em um chip.

- Permite a quantificação de múltiplos miRNAs simultaneamente.

- Menos sensível que qRT-PCR, mas útil para perfis de expressão de larga escala.

- Digital PCR (dPCR):

- Uma técnica avançada para quantificação absoluta de miRNAs.

- Divide a amostra em milhares de pequenas reações para amplificação individual, permitindo a quantificação exata das cópias de miRNA.

- Hibridização in situ (ISH):

- Permite a localização espacial de miRNAs dentro de células ou tecidos, usando sondas de oligonucleotídeos marcadas.

- Útil para estudos de expressão tecidual.

4. Validação Funcional:

- Knockdown ou Overexpressão de miRNA:

- Usado para investigar o papel funcional dos miRNAs.

- Pode ser realizado utilizando inibidores de miRNA (antagomirs) ou miméticos de miRNA.

Considerações Finais:

A escolha da técnica depende do objetivo do estudo, da quantidade e da qualidade da amostra disponível, da necessidade de quantificação absoluta ou relativa, e dos recursos laboratoriais. A combinação de diferentes métodos pode ser necessária para confirmar resultados e obter uma compreensão abrangente dos miRNAs em estudo.