DNMT's ( DNA metiltransferases ) e patologias hematopoiéticas

DNMT's ( DNA metiltransferases ) e patologias hematopoiéticas

A metilação do DNA é um regulador importante da expressão genética e organização genómica. A metilação CpG dos genes promotores associa-se ao silenciamento da transcripção.

http://www.youtube.com/watch?v=29doT6Hf2MI

Alterações do padrão normal da metilação do DNA, quer seja aumento local que resulta em silenciamento de genes reguladores do ciclo celular específico, quer seja uma redução global na metilação do DNA, ambos estão envolvidos em muitos tipos de neoplasias.

http://www.youtube.com/watch?v=N2LbVMcQbLk

A metilação CpG envolve a transferência de um grupo metilo para a posição 5 da citosina, originando a 5-metilcitosina   (  5mC  ),  do    dinucleotídeo   CpG,   reacção   esta   catabolizada   pela   DNA metiltransferase ( DNMTs ). Pela acção das proteínas da família TET, e particularmente TET 2, a 5-metilcitosina é convertida em 5-hidroximetilcitosina ( 5hmC ), forma esta de metilação prevalente em neurónios e stem cells embrionárias, entre outras. Embora não se conheça ainda a função da 5hmC, pode esta representar uma via pela qual o DNA metilado em 5mC ser convertido num estado não metilado.

Outras 2 formas de metilação do DNA, relacionadas com 5hmC, foram descritas, nomeadamente 5-formilcitosina  (  5fC  )  e  5-carboxicitosina  (  5caC  ),  sendo  as  proteínas da famíla TET ( TET 1, TET 2 e TET 3 ) envolvidas nestas reacções de metilação

A 5-carboxicitosina, pela acção da timina DNA glicosidase ( TDG ) gera citosina e assim completa a desmetilação.

Alternativamente, 5hmC pode converter-se em 5-hidroximetiluracilo ( 5hmU ), convertendo-se em citosina pela acção da desmetilação mediada pela via da reparação de excisão das bases.

TET 2 está envolvida na modificação oxidativa das bases dos ácidos nucleicos, e particularmente cataliza a conversão de 5-metilcitosina em 5-hidroximetilcitosina.

A família TET é caracterizada por um domínio amino terminal CXXC, com um dedo de zinco, e um domínio carboxi terminal catalítico Fe (II)- e 2-oxoglutarato desoxigenase dependente

TET 2 é expressado em múltiplos tecidos ao nível do mRNA , mas a expressão é mais elevada nas células hematopoiéticas e particularmente granulócitos.

TET 2 está envolvido em processos como regulação positiva da transcripção e diferenciação celular e, por esta razão, as suas mutações frequentemente se envolvem em doenças hematopoiéticas.

TET 2   é  uma   proteína   de   localização   nuclear,   sendo   a   sua   localização   regulada   pelas  proteínas  AID ( activation-induced cytidine deaminase ) e IDAX. Mutação do domínio CXXC da IDAX, altera a localização nuclear da proteína TET 2..

As proteínas da família TET usam o oxigéneo molecular para transferirem um grupo hidroxil para a 5-metilcitosina, originando a 5-hidroximetilcitosina. As proteínas da família TET, para além desta função, também podem oxidar 5hmC a 5fC ou 5caC.

TET 2 tem uma acção importante na manutenção da desmetilação do DNA.

Stress oxidativo aumenta a actividade da TET 2 pois diminui as concentrações de NADPH e NADH promovendo as reacções do ciclo TCA e, dessa forma, a produção de 2-oxoglutarato ( 2-OG ) dependente de IDH.

O ácido ascórbico ( vitamina C ) aumenta a geração de 5hmC por actuar como cofactor de TET 2.

Envolvimento dos genes da família TET em patologias

TET 1  foi  reportado  estar  envolvido  na  leucemia  de  linhagem  mista,  por  ser  o  parceiro  de  fusão com o MLL ( gene da leucemia de linhagem mista ou leucemia mielóide linfóide ) em doentes com LMA com translocação t(10;11)(q22;q23).

TET 2 tem sido relacionado, em caso de mutação, com patologias hematológicas malignas, nomeadamente SMD, LMA primária e secundária e LMMC.

A importância da alimentação não se restringe ao seu conteúdo nutricional, mas também à regulação epigenética dos perfis de expressão dos genes.

A abundância relativa da energia dos metabolitos, permite a célula sentir o seu estado energético e dessa forma uma redução de NADPH e ATP induz a desmetilação do DNA através do ciclo de TCA ( ciclo do ácido cítrico ) sugerindo um papel epigenético como uma ligação mecanística entre o metabolismo energético e o controlo da expressão dos genes.

http://www.youtube.com/watch?v=-TiDIThfej4

A geleia real diminui a metilação do DNA. Um dos aminoácidos mais frequentes na geleia real é a glutamina.

TET 1 e TET 2 estão envolvidos principalmente em neoplasias hematológicas. Glutamina apresenta-se em quantidades superiores em TET 2, comparativamente com TET 1 ou TET 3. Glutamina é o precursor do glutamato, que é o substracto da glutamato desidrogenase que produz 2-oxoglutarato usado pelo TET 2. Em estado catabólico ( redução de ATP, NADPH, hipóxia ) as células aumentam a produção de 2-oxoglutarato por aceleração do ciclo do ácido cítrico e promoção da actividade da glutamina sintetase. Hipóxia é necessária para a manutenção dos nichos das stem cells. Assim pode-se deduzir que o papel da TET 2 na hematopoiese pode ser devido a recursos metabólicos do tecido hematopoiético.

A composição em aminoácidos de TET 1 é semelhante à de TET 2, mas TET 3 tem uma composição diferente. TET 1 e TET 2 tem um importante papel no stemness ( ninho de stem cells – microambiente onde as stem cells são encontradas ) mas não nas células ES ( células ES são células mãe embrionárias derivadas da massa celular interna de um blastocisto, capazes de contribuir na formação de tecidos somáticos e tecidos germinativos ). Queda do nível de TET 1, mas não de TET 2 ou TET 3, impede as células ES de se auto-renovarem e manterem ( a fusão Tel/PDGFRβ também é responsável pela inibição da autorrenovação das células ES ).

Células ES

Neoplasias hematológicas, tais como SMD e doenças mieloproliferativas, resultam da expansão clonal desregulada das stem cells ou progenitores das células hematopoiéticas.

Papel importante na iniciação e desenvolvimento de tipos diferentes de doenças malignas hematológicas, a par com defeitos moleculares que envolvem factores citosólicos de sinalização e transcripção ( JAK, STAT, etc.) tem sido atribuído às vias reguladoras epigenéticas para o estabelecimento da função e diferenciação das stem cells, enquanto que mutações de reguladores epigenéticos ( tais como DNMT3A, isocitrato desidrogenase 1 e 2, TET 2, EZH2, UTX, ASXL 1 ) jogam uma função importante na iniciação e desenvolvimento de distintas patologias hematológicas.

As vias epigenéticas controlam a expressão genética por meio da regulação da metilação do DNA e modificação dos resíduos de histonas dos nucleossomas à volta das quais a dupla hélice do DNA faz rotação.

Verificou-se que na LMA M5 e LMA M4 há uma alta frequência de mutação da DNMT3A, mas pode esta mutação requerer mutações de outros genes chave.

A metilação do DNA é realizada com a ajuda dos DNMT's que catalizam a adição de um grupo metilo no carbono 5 da citosina, produzindo 5-metilcitosina.

Até agora foram descritos 2 tipos de DNA metiltransferases: metiltransferases de novo e metiltransferases de manutenção. Enquanto que a forma de novo produz dinucleotídeos CpG hemimetilados na dupla hélice do DNA e são responsáveis pelo estabelecimento do padrão da metilação, já a forma de manutenção adiciona metilações ao DNA quando uma cadeia já está metilada e é responsável por manter o padrão de metilação estabelecido pela metiltransferase de novo.

Existem 3 tipos de DNMTs: DNMT 1, DNMT 2 e DNMT 3, de acordo com os dados catalíticos da metilação.

http://www.youtube.com/watch?v=tiIy6TNb5cA

DNMT1 ( DNA metiltransferase 1 )

DNMT1, ou metiltransferase de manutenção, tem como principal função a manutenção da metilação em forte associação com a replicação do DNA. Formada por 2 domínios principais: CXXC com um dedo de zinco, que especificamente reconhece CpG não metilado, e um par de domínios BAH ( bromo adjacent homology ).

DNMT1 preferencialmente metila DNA hemi-metilado. DNMT1 joga um papel importante na regulação da auto-renovação das stem cells hematopoiéticas, e o comprometimento das linhagens linfóide versus mielóide. Stem cells hematopoiéticas pobres em DNMT1 diferenciam-se em células mielóides-eritróides mais que linfóides.

DNMT2

É o membro da família DNMT mais conservado. Tem apenas o domínio catalítico e tem a capacidade de ligar SAM ( S-adenosilmetionina ) na mesma conformação de DNMT1. DNMT2 não mostra actividade DNA metilase. DNMT2 não metila o DNA mas metila tRNA Asp-GTC no resíduo citosina 38 na ansa anticodão.

Outros tRNA ( tRNA Val-AAC e tRNA Gly-GCC ) também são metilados por DNMT2

DNMT 3

Há 3 DNMT3 ( DNMT3A, DNMT3B e DNMT3L ) que, comparados com a DNMT1, apresentam um N-terminal mais curto, não apresentando CXXC e domínio BAH, que são substituídos por um domínio PWWP ( prolina-triptofano-triptofano-prolina ) e um domínio ADD.

DNMT3A e DNMT3B são as principais metiltransferases de novo, enquanto que a DNMT3L actua como factor de regulação da DNMT3A.

DNMT3B é expressada a níveis mais altos nas células CD34+ da medula óssea, mas hiporreguladas nas células hematopoiéticas diferenciadas. Na LMA verifica-se um aumento acentuado do nível dos transcriptos de DNMT3B. Uma hiporregulação de DNMT3B pode contribuir para a patogénese da leucemia por indução de hipermetilação regional aberrante.

Mutação de DNMT3B pode provocar desregulação genética associada a linfogénese através de efeitos indirectos na expressão do gene interferente com as normais sinalização, maturação e migração dos linfócitos.

DNMT3L

Parece ter como função a regulação ou ser co-factor de DNMT3A no processo de metilação de novo

A metilação do DNA joga um papel importante na proliferação celular e sua diferenciação bem como na reprogramação celular somática através da alteração da expressão genética.

Anormalidades da DNMT3A em neoplasias hematológicas

Para uma completa evolução de uma leucemia, é necessário a cooperação entre mutações classe I, que envolvem genes codificadores de proteínas das vias de transdução do sinal ( como as tirosina quinases ) e conferem vantagens proliferativas e de sobrevivência para as células hematopoiéticas, e mutações classe II que rompem os factores de transcripção e levam à inibição da diferenciação hematopoiética e, subsequente, apoptose. Para além destes 2 grupos , evidências recentes apontam para uma nova categoria de mutação genética associada com regulação epigenética, tais como as mutações de DNMT3A, IDH 1, IDH 2 e TET 2, sendo a incidência destas mutações considerável nas neoplasias hematológicas, resultando em alterações da metilação do DNA e/ou perfis de modulação das histonas com aberração dos padrões de expressão genéticos.

Este terceiro tipo de mutação é frequentemente encontrado em doentes idosos com LMA, que apresentam hiperleucocitose, infiltração dos órgãos mais severa e, dessa forma, prognóstico mais grave.

Na LMA M4 e M5 uma variedade de mutação foi identificada em quase todos os domínios da DNMT3A mas, no entanto, uma mutação em R882 foi observada em todos os casos. Clinicamente os casos de LMA com mutação DNMT3A são preferencialmente associados com LMA M4 ou M5, com início tardio da doença, hiperleucocitose e prognóstico extremamente severo em termos de sobrevivência média e período assintomático.

Desregulação do TET 2 e doenças mielóides malignas

Desregulação do TET 2 e doenças mielóides malignas

Em muitos cancros, incluindo doenças hematológicas malignas, verifica-se o aparecimento de mutações aberrantes do DNA, sendo a hipermetilação dos genes supressores tumorais uma dessas aberrações. Esta característica levou à procura, e posterior descoberta, de agentes com a capacidade de reverter a hipermetilação, como sejam inibidores da metiltransferase do DNA, que se tem vindo a tornar encorajante no tratamento da SMD e algumas leucemias agudas.

O gene TET 2 α-cetoglutarato dependente é fortemente relacionado com o TET 1, cujo produto proteico é responsável pela conversão do 5mC ( 5- metilcitosina ) em 5hmC ( 5-hidroximetilcitosina ) no DNA. Mutações somáticas no gene TET 2 ocorrem com frequência nos doentes com doenças mielóides malignas, incluindo SMD, LMA, neoplasias mieloproliferativas e LMMC.

Mutações de TET 2 associam-se com baixos níveis de 5hmC comparativamente com controlos saudáveis.

Verificou-se que a desregulação de TET 2 está associada com a hipometilação mais do que com a hipermetilação. Conclui-se que TET 2 joga um importante papel na mielopoiese normal, existindo uma forte associação entre doenças mielóides malignas e a perda da função catalítica do TET 2. Também está proposto que o nível de 5hmC celular de doentes com doenças malignas mielóides pode ter significado prognóstico independente e proporcionar a base terapêutica destas patologias.

Na LMA, mutações do gene do metabolismo do citrato ( isocitrato desidrogenase 1 e 2 – IDH 1 e IDH 2 ) foram demonstradas terem papel relevante por interferência da função do gene TET 2.

Mutações de IDH1 e IDH 2 resultam em produção de 2 hidroxiglutamato e inibição da função de TET 2

TET 2 ( ten eleven translocation 2 ou metilcitosina desoxigenase 2 ) é o gene que dá as instruções para o fabrico de uma proteína envolvida na regulação do processo de transcripção, primeiro processo da síntese proteica.

Embora a proteína TET 2 exista em todo o organismo, ela joga um papel particularmente importante na produção sanguínea a partir das stem cells hematopoiéticas, localizadas na medula óssea, e que originam as 3 linhas celulares sanguíneas ( leucócitos, eritrócitos e plaquetas ). A proteína TET 2 actua como supressor tumoral prevenindo as células de crescerem e dividirem de forma descontrolada.

Mutação somática do gene TET 2 foi observada em alguns doentes com trombocitémia essencial. Nesta condição patológica, a mutação do gene TET 2 altera a proteína TET 2 de formas diferentes, resultando todas elas numa proteína não funcional.

Na policitémia vera verifica-se, em alguns casos, a ocorrência da mutação TET 2, resultando na produção de uma proteína não funcional. Isto ocorre em cerca de 16% dos casos de policitémia vera.

Mutação do gene TET 2 associa-se à mielofibrose primária, sendo desconhecido o papel desta mutação na patologia.

Mutações do gene TET 2 associam-se ainda a outras patologias tumorais, como sejam leucemias e síndrome mielodisplásico. A perda da proteína TET 2 nas stem cells hematopoiéticas pode levar ao crescimento descontrolado e divisão destas células.

Cromossoma 4

O gene TET 2 localiza-se no braço longo do cromossoma 4, na posição 24. A mutação deste gene foi inicialmente identificada em neoplasias mielóides, com delecção ou dissomia uniparental, na localização 4q24.

Como se referiu anteriormente, o gene TET 2 codifica uma proteína que suprime o crescimento tumoral. Este gene TET 2 está mutado em cerca de 16% dos doentes com policitémia vera e 22% dos doentes com SMD ou LMA.

Em cerca de 60% dos doentes com o gene TET 2 mutado, associam-se outras mutações e anormalidades cromossómicas protectoras, conhecidas como risco citogenético “bom”. Em comparação, apenas cerca de 40% dos doentes com gene TET 2 normal, não mutado, apresentam risco citogenético “bom”.

TET 2 localiza-se numa região ( 4q24 ) que apresenta recorrentes microdelecções e cópias de perda neutral de heterozigocidade ( LOH ) em doentes com várias malignidades mielóides. Mutações somáticas do gene TET 2 são frequentemente observadas em doentes com SMD, neoplasias mieloproliferativas, síndrome mieloproliferativo mielodisplásico, LMMC, LMA e LMA secundária.

Stem cells hematopoiéticas  com alterações em TET 2 são capazes de reconstituirem a multilinhagem sanguínea e possuem uma vantagem competitiva sobre as stem cells normais, resultando numa hematopoiese aumentada tanto na linhagem linfóide como mielóide.

Alteração de TET 2 atrasa a diferenciação das stem cells hematopoiéticas e desvia o desenvolvimento para a linhagem monocítica/macrofágica.

TET 2 tem um papel crítico na regulação da expansão e função das stem cells hematopoiéticas, provavelmente pelo controlo dos níveis de 5hmC nos genes importantes no envolvimento da auto-renovação, proliferação e diferenciação das stem cells hematopoiéticas.

A incidência da mutação TET 2 associa-se com a idade, sendo maior nos doentes com mais de 50 anos ( 17% dos doentes com mais de 50 anos e 9% nos doentes com menos de 50 anos apresentam a mutação TET 2 ).

A SMD é uma alteração clonal da hematopoiese que se caracteriza por displasia , hematopoiese ineficaz e citopenias periféricas. A evolução da SMD para LMA ocorre em cerca de 25% dos casos.

A proteína TET 2 é um membro da família das proteínas TET constituída por 3 proteínas ( TET 1, TET 2 e TET 3 ) que partilham entre si 2 domínios fortemente conservados. A proteína TET 1 foi implicada na leucemia como parceiro de fusão do produto do gene MLL ( gene da leucemia de linhagem mista ou leucemia mielóide linfóide ) na translocação cromossómica t(10;11)(p12;q23) e foi demonstrado ser capaz de hidroximetilação e assim contribuir para a metilação da citosina e regulação epigenética do gene. Foram identificadas mutações do gene TET 2 em 19-26% dos casos com SMD e cerca de 50% dos casos de LMMC, sendo desta forma esta mutação uma das mais frequentes nestas neoplasias mielóides.

Importante assinalar que embora as mutações TET 2 sejam um acontecimento precoce deste tipo de doenças ( mieloproliferativas e mielodisplásicas ) e surjam mesmo lesões pré-JAK 2 nas neoplasias mieloproliferativas ( policitémia vera, trombocitose essencial e mielofibrose primária ), as mutações TET 2 e JAK 2 podem ocorrer, e ocorrem na maioria dos casos, independentemente uma da outra. Isto é sublinhado nos casos em que a mutação TET 2 ocorre apenas na altura da transformação leucémica mielóide das neoplasias mieloproliferativas.

Na maioria dos casos, a mutação do gene TET 2 causa inactivação da proteína TET 2, sugerindo um papel de supressor tumoral desta proteína TET 2. De salientar que o mRNA do TET 2 é fortemente expressado nas células progenitoras mielóides normais, granulócitos normais ou eritrócitos normais em contraste com o que se verifica de reduzida expressão de TET 2 naquelas células em doentes com SMD.

As regiões conservadas na família de proteínas TET ( regiões cons'd 1 e 2 ) são implicadas na conversão de 5-metilcitosina para 5-hidroximetilcitosina e correspondem, essas regiões, aos amino-ácidos 1104 - 1478 e 1845 – 2002, respectivamente.

Múltiplas mutações podem ocorrer no mesmo doente, simultaneamente.

Significativo o facto de SMD com a anormalidade 5q- não costumar apresentar a mutação TET 2.

Estado citogenético, sexo, subtipos WHO, transformação para LMA e score IPSS não se correlacionam, habitualmente, com a mutação TET 2. Também não se atribui associação clínica com o tamanho da mutação clonal ou a presença de mutação singular versus múltipla do TET 2

Homozigocidade para a mutação TET 2 é definida como uma abundância relativa de mutação ( RMA ) superior a 65%

A sobrevivência global não é afectada pela homozigocidade, existência ou não da mutação TET 2, alto ou baixo nível da mutação, presença de mutação única ou múltipla ou score IPSS.

Pode-se dizer que a presença da mutação TET 2 não influencia a sobrevivência global destes doentes. Idade avançada do doente, classificação WHO e subtipo citogenético são as únicas variáveis que significativamente afectam a sobrevivência global destes doentes.

As mutações TET 2 têm sido identificadas numa gama de doenças malignas mielóides e são das mais frequentes mutações genéticas associadas a SMD, sendo estas mutações de significado prognóstico ainda controverso.

Um dado importante é a variedade de clones com baixa abundância de mutação TET 2.

A existência de baixo, mas significativo, número de clones minor é indicativa da evolução clonal da doença. Este facto é sublinhado por vários casos de mutações múltiplas, onde se observa uma mutação dominante, e outras populações pouco abundantes, sugerindo uma competição clonal.

Foi sublinhada a ocorrência de mutação TET 2 em células CD 34, reforçando a ideia desta aberração genética ser uma lesão inicial da doença.

A mutação TET 2 é ubiquitativa entre as linhagens mielóides e linfóides, sugerindo que tal mutação ocorre precocemente na hematopoiese. A mutação TET 2, como anteriormente se referiu, precede a mutação JAK2V617F nas neoplasias mieloproliferativas.

Mutações TET 2 e aberrações genómicas afectando o locus 4q24 são acontecimentos independentes, e podem não ocorrer os dois simultaneamente, como é o caso do surgimento de LOH ( lost of homozygosity ) e mutação TET 2 em alguns doentes com SMD.

Uma  característica  importante  da  SMD  é  o  aumento  da  frequência  da dissomia uniparental ( UPD ) que é uma medida indirecta da instabilidade genómica. Não se verificam diferenças significativas entre doentes com mutação TET 2 ou sem ela na frequência das UPD, sugerindo que os defeitos TET 2 não contribuem para a instabilidade genómica geral.

Não há evidência que os casos com homo ou hemizigotia para a mutação TET 2 apresentam reduzida sobrevivência, comparativamente com os casos de mutação heterozigótica, como se poderia esperar se o TET 2 aberrante orientasse a doença independentemente. A falta de correlação entre a presença de mutação de TET 2 e o prognóstico da SMD sugere que vários outros factores afectam o fenótipo do SMD, apesar da aquisição da mutação somática TET 2 ser um acontecimento relevante na patogenia e transformação de SMD.

Nas neoplasias mieloproliferativas o aparecimento da mutação TET 2 associa-se com a transformação para LMA.