DNMT's
( DNA metiltransferases ) e patologias hematopoiéticas
A
metilação do DNA é um regulador importante da expressão genética
e organização genómica. A metilação CpG dos genes promotores
associa-se ao silenciamento da transcripção.
Alterações
do padrão normal da metilação do DNA, quer seja aumento local que
resulta em silenciamento de genes reguladores do ciclo celular
específico, quer seja uma redução global na metilação do DNA,
ambos estão envolvidos em muitos tipos de neoplasias.
A
metilação CpG envolve a transferência de um grupo metilo para a
posição 5 da citosina, originando a 5-metilcitosina ( 5mC ), do dinucleotídeo CpG, reacção esta catabolizada pela DNA metiltransferase ( DNMTs ). Pela acção das proteínas da família
TET, e particularmente TET 2, a 5-metilcitosina é convertida em
5-hidroximetilcitosina ( 5hmC ), forma esta de metilação prevalente
em neurónios e stem cells embrionárias, entre outras. Embora não
se conheça ainda a função da 5hmC, pode esta representar uma via
pela qual o DNA metilado em 5mC ser convertido num estado não
metilado.
Outras
2 formas de metilação do DNA, relacionadas com 5hmC, foram
descritas, nomeadamente 5-formilcitosina ( 5fC ) e 5-carboxicitosina ( 5caC ), sendo as proteínas da famíla TET ( TET 1, TET 2 e TET 3 )
envolvidas nestas reacções de metilação
A
5-carboxicitosina, pela acção da timina DNA glicosidase ( TDG )
gera citosina e assim completa a desmetilação.
Alternativamente,
5hmC pode converter-se em 5-hidroximetiluracilo ( 5hmU ),
convertendo-se em citosina pela acção da desmetilação mediada
pela via da reparação de excisão das bases.
TET
2 está envolvida na modificação oxidativa das bases dos ácidos
nucleicos, e particularmente cataliza a conversão de 5-metilcitosina
em 5-hidroximetilcitosina.
A
família TET é caracterizada por um domínio amino terminal CXXC,
com um dedo de zinco, e um domínio carboxi terminal catalítico Fe
(II)- e 2-oxoglutarato desoxigenase dependente
TET
2 é expressado em múltiplos tecidos ao nível do mRNA , mas a
expressão é mais elevada nas células hematopoiéticas e
particularmente granulócitos.
TET 2 está
envolvido em processos como regulação positiva da transcripção e
diferenciação celular e, por esta razão, as suas mutações
frequentemente se envolvem em doenças hematopoiéticas.
TET
2 é uma proteína de localização nuclear, sendo a sua localização regulada pelas proteínas AID ( activation-induced cytidine deaminase
) e IDAX. Mutação do domínio CXXC da IDAX, altera a
localização nuclear da proteína TET 2..
As
proteínas da família TET usam o oxigéneo molecular para
transferirem um grupo hidroxil para a 5-metilcitosina, originando a
5-hidroximetilcitosina. As proteínas da família TET, para além
desta função, também podem oxidar 5hmC a 5fC ou 5caC.
TET
2 tem uma acção importante na manutenção da desmetilação do
DNA.
Stress
oxidativo aumenta a actividade da TET 2 pois diminui as concentrações
de NADPH e NADH promovendo as reacções do ciclo TCA e, dessa forma,
a produção de 2-oxoglutarato ( 2-OG ) dependente de IDH.
O
ácido ascórbico ( vitamina C ) aumenta a geração de 5hmC por actuar como
cofactor de TET 2.
Envolvimento
dos genes da família TET em patologias
TET
1 foi reportado estar envolvido na leucemia de linhagem mista, por ser o parceiro de fusão com o MLL ( gene da leucemia de linhagem
mista ou leucemia mielóide linfóide ) em doentes com LMA com
translocação t(10;11)(q22;q23).
TET
2 tem sido relacionado, em caso de mutação, com patologias
hematológicas malignas, nomeadamente SMD, LMA primária e secundária
e LMMC.
A
importância da alimentação não se restringe ao seu conteúdo
nutricional, mas também à regulação epigenética dos perfis de
expressão dos genes.
A
abundância relativa da energia dos metabolitos, permite a célula
sentir o seu estado energético e dessa forma uma redução de NADPH
e ATP induz a desmetilação do DNA através do ciclo de TCA ( ciclo
do ácido cítrico ) sugerindo um papel epigenético como uma ligação
mecanística entre o metabolismo energético e o controlo da
expressão dos genes.
A
geleia real diminui a metilação do DNA. Um dos aminoácidos mais
frequentes na geleia real é a glutamina.
TET
1 e TET 2 estão envolvidos principalmente em neoplasias
hematológicas. Glutamina apresenta-se em quantidades superiores em
TET 2, comparativamente com TET 1 ou TET 3. Glutamina é o precursor
do glutamato, que é o substracto da glutamato desidrogenase que
produz 2-oxoglutarato usado pelo TET 2. Em estado catabólico (
redução de ATP, NADPH, hipóxia ) as células aumentam a produção
de 2-oxoglutarato por aceleração do ciclo do ácido cítrico e
promoção da actividade da glutamina sintetase. Hipóxia é
necessária para a manutenção dos nichos das stem cells. Assim
pode-se deduzir que o papel da TET 2 na hematopoiese pode ser devido
a recursos metabólicos do tecido hematopoiético.
A
composição em aminoácidos de TET 1 é semelhante à de TET 2, mas
TET 3 tem uma composição diferente. TET 1 e TET 2 tem um importante
papel no stemness ( ninho de stem cells – microambiente onde as
stem cells são encontradas ) mas não
nas células ES ( células ES são células mãe embrionárias
derivadas da massa celular interna de um blastocisto, capazes de
contribuir na formação de tecidos somáticos e tecidos germinativos
). Queda do nível de TET 1, mas não de TET 2 ou TET 3, impede as
células ES de se auto-renovarem e manterem ( a fusão Tel/PDGFRβ também é responsável pela inibição da autorrenovação das células ES ).
Células
ES
Neoplasias
hematológicas, tais como SMD e doenças mieloproliferativas,
resultam da expansão clonal desregulada das stem cells ou
progenitores das células hematopoiéticas.
Papel
importante na iniciação e desenvolvimento de tipos diferentes de
doenças malignas hematológicas, a par com defeitos moleculares que
envolvem factores citosólicos de sinalização e transcripção (
JAK, STAT, etc.) tem sido atribuído às vias reguladoras
epigenéticas para o estabelecimento da função e diferenciação
das stem cells, enquanto que mutações de reguladores epigenéticos
( tais como DNMT3A, isocitrato desidrogenase 1 e 2, TET 2, EZH2, UTX,
ASXL 1 ) jogam uma função importante na iniciação e
desenvolvimento de distintas patologias hematológicas.
As
vias epigenéticas controlam a expressão genética por meio da
regulação da metilação do DNA e modificação dos resíduos de
histonas dos nucleossomas à volta das quais a dupla hélice do DNA
faz rotação.
Verificou-se
que na LMA M5 e LMA M4 há uma alta frequência de mutação da
DNMT3A, mas pode esta mutação requerer mutações de outros genes
chave.
A
metilação do DNA é realizada com a ajuda dos DNMT's que catalizam
a adição de um grupo metilo no carbono 5 da citosina, produzindo
5-metilcitosina.
Até
agora foram descritos 2 tipos de DNA metiltransferases:
metiltransferases de novo e metiltransferases de manutenção.
Enquanto que a forma de novo produz dinucleotídeos CpG
hemimetilados na dupla hélice do DNA e são responsáveis pelo
estabelecimento do padrão da metilação, já a forma de manutenção
adiciona metilações ao DNA quando uma cadeia já está metilada e é
responsável por manter o padrão de metilação estabelecido pela
metiltransferase de novo.
Existem
3 tipos de DNMTs: DNMT 1, DNMT 2 e DNMT 3, de acordo com os dados
catalíticos da metilação.
DNMT1
( DNA metiltransferase 1 )
DNMT1,
ou metiltransferase de manutenção, tem como principal função a
manutenção da metilação em forte associação com a replicação
do DNA. Formada por 2 domínios principais: CXXC com um dedo de
zinco, que especificamente reconhece CpG não metilado, e um par de
domínios BAH ( bromo adjacent homology ).
DNMT1
preferencialmente metila DNA hemi-metilado. DNMT1 joga um papel
importante na regulação da auto-renovação das stem cells
hematopoiéticas, e o comprometimento das linhagens linfóide versus
mielóide. Stem cells hematopoiéticas pobres em DNMT1 diferenciam-se
em células mielóides-eritróides mais que linfóides.
DNMT2
É
o membro da família DNMT mais conservado. Tem apenas o domínio
catalítico e tem a capacidade de ligar SAM ( S-adenosilmetionina )
na mesma conformação de DNMT1. DNMT2 não mostra actividade DNA
metilase. DNMT2 não metila o DNA mas metila tRNA Asp-GTC no resíduo
citosina 38 na ansa anticodão.
Outros
tRNA ( tRNA Val-AAC e tRNA Gly-GCC ) também são metilados por DNMT2
DNMT
3
Há
3 DNMT3 ( DNMT3A, DNMT3B e DNMT3L ) que, comparados com a DNMT1,
apresentam um N-terminal mais curto, não apresentando CXXC e domínio
BAH, que são substituídos por um domínio PWWP (
prolina-triptofano-triptofano-prolina ) e um domínio ADD.
DNMT3A
e DNMT3B são as principais metiltransferases de novo,
enquanto que a DNMT3L actua como factor de regulação da DNMT3A.
DNMT3B
é expressada a níveis mais altos nas células CD34+ da medula
óssea, mas hiporreguladas nas células hematopoiéticas
diferenciadas. Na LMA verifica-se um aumento acentuado do nível dos
transcriptos de DNMT3B. Uma hiporregulação de DNMT3B pode
contribuir para a patogénese da leucemia por indução de
hipermetilação regional aberrante.
Mutação
de DNMT3B pode provocar desregulação genética associada a
linfogénese através de efeitos indirectos na expressão do gene
interferente com as normais sinalização, maturação e migração
dos linfócitos.
DNMT3L
Parece
ter como função a regulação ou ser co-factor de DNMT3A no
processo de metilação de novo
A
metilação do DNA joga um papel importante na proliferação celular
e sua diferenciação bem como na reprogramação celular somática
através da alteração da expressão genética.
Anormalidades
da DNMT3A em neoplasias hematológicas
Para
uma completa evolução de uma leucemia, é necessário a cooperação
entre mutações classe I, que envolvem genes codificadores de
proteínas das vias de transdução do sinal ( como as tirosina
quinases ) e conferem vantagens proliferativas e de sobrevivência
para as células hematopoiéticas, e mutações classe II que rompem
os factores de transcripção e levam à inibição da diferenciação
hematopoiética e, subsequente, apoptose. Para além destes 2 grupos
, evidências recentes apontam para uma nova categoria de mutação
genética associada com regulação epigenética, tais como as
mutações de DNMT3A, IDH 1, IDH 2 e TET 2, sendo a incidência
destas mutações considerável nas neoplasias hematológicas,
resultando em alterações da metilação do DNA e/ou perfis de
modulação das histonas com aberração dos padrões de expressão
genéticos.
Este
terceiro tipo de mutação é frequentemente encontrado em doentes
idosos com LMA, que apresentam hiperleucocitose, infiltração dos
órgãos mais severa e, dessa forma, prognóstico mais grave.
Na
LMA M4 e M5 uma variedade de mutação foi identificada em quase
todos os domínios da DNMT3A mas, no entanto, uma mutação em R882
foi observada em todos os casos. Clinicamente os casos de LMA com
mutação DNMT3A são preferencialmente associados com LMA M4 ou M5,
com início tardio da doença, hiperleucocitose e prognóstico
extremamente severo em termos de sobrevivência média e período
assintomático.
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