Proteina Rho

Proteína Rho

Proteína Rho é uma proteína hexamérica, encontrada em eucariotas e procariotas, necessária para a terminação da transcripção de determinados genes. É uma proteína pertencente à família das helicasas.

Constitui um método de terminação da transcripção alternativo ao habitual ( as sequências de terminação palindrómicas nas quais o transcripto primário se torna anticomplementar e dissocia do RNA polimerase ). Em locais sem sinais de terminação, a transcripção detém-se mediante as proteínas Rho, que se unem a zonas de RNA desnudadas, denominadas sítios nut, hidrolizando o ATP com geração de energia utilizada para fechar a transcripção e expulsar o RNA

A proteína Rho está envolvida no controlo do ciclo celular, expressão de genes e organização da actina.

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Nos procariotas, o final da transcripção é um processo bem controlado, no qual sequências típicas de transcriptos de RNA ( sinais de término ) indicam o local para a finalização da síntese dessa molécula.

Término Rho

O término Rho dependente não possui adenilatos na fita de DNA molde, mas sim uma sequência curta que é transcripta, formando um grampo. A RNA polimerase, ao passar por esta zona faz uma pausa e, se a proteína Rho estiver presente, dissocia-se. A proteina Rho possui actividade RNA-DNA helicase dependente do ATP, rompendo o híbrido.

Os sinais activos para o fim da transcripção encontram-se no RNA recém-sintetizado e não no molde de DNA.

A proteína Rho é hexamérica e cada subunidade tem um domínio de ligação ao RNA e um domínio de hidrólise do ATP. O local de ligação para a proteína Rho é uma extensa ( cerca de 70 nucleotídeos, por vezes sendo 80-100 nucleotídeos ) região de cadeia única, rica em citosina e pobre em guanina, chamada de local de utilização da Rho ou rut ( Rho utilization site ) no RNA que está a ser sintetizado. O Rho liga-se ao RNA e usa a sua actividade ATPase para prover a energia para translocar ao longo de RNA até atingir a região helicoidal RNA-DNA, onde desfaz a hélice da estrutura dupla híbrida.

A RNA polimerase pára na sequência terminal, pausa esta devida a haver um local específico, afastada de 100 nucleotídeos do local de ligação da proteína Rho, chamado essa região de local de pausa Rho-sensível.

Assim o factor Rho, ou proteína Rho, actua como uma enzima desenroladora ATP-dependente, que se move ao longo do RNA em sintetização, em direcção ao extremo 3', e desenrolando-o a partir do DNA molde à medida que isso procede.

Nos eucariotas, a família das proteínas Rho GTPase é uma família de pequenas proteínas G ( 21 kDa ) de sinalização, constituindo uma subfamília da superfamília ras.

Os membros da família Rho GTPase regulam muitos aspectos da dinâmica intracelular da actina e encontram-se em todos os organismos eucariotas. As proteínas Rho representam um papel no desenvolvimento dos organelos, dinâmica do citoesqueleto, movimento celular e outras funções celulares. A família das proteínas Rho GTPase é formada, nos mamíferos, por 20 membros diferentes, distribuídos por 8 subfamílias ( Rho, Rnd, Rho D/F, Rho H, Rac, Cdc42, Rho U/V e Rho BTB ).

Cada proteína Rho afecta numerosas cascatas proteicas, cada uma das quais tendo papéis importantes em vários processos celulares.

Mais de 60 alvos foram descritos para as 3 mais comuns proteínas Rho GTPase.

As proteínas Rho ajudam as células animais a regular a sua forma. Uma óbvia alteração da morfologia celular controlada pelas proteínas Rho é a formação de lamellipodia e filipodia, um processo que leva à manutenção de certas células. Nas zonas sem sinalização de terminação, a transcripção pode deter-se em presença das proteínas Rho. Estas proteínas unem-se a zonas de RNA desnudo, chamadas rut e hidrolizam o ATP gerando energia que inicia o encerramento da bolha de transcripção e expulsa o RNA

A enterotoxina A do C.difficile exibe actividade citotóxica que induz uma desestruturação do citoesqueleto de actina, acompanhado por alterações morfológicas. A despolimerização, induzida pela toxina A, dos filamentos de actina correlaciona-se com o decréscimo da ADP-ribosilação das proteínas Rho GTPase de baixa massa molecular. A modificação da massa da proteína Rho induzida pela toxina A foi de 162 Da, o que indica haver uma incorporação de uma hexose na proteína Rho. Três membros da família Rho ( RhoA, Rac 1 e Cdc42Hs ) são substracto para a toxina A, enquanto que H-ras, Rab-5 e Arf1 não eram glicosilados.

Glicosilação das proteínas do subtipo Rho parece ser o mecanismo molecular pelo qual a toxina A do C.difficile medeia o seu efeito citotóxico nas células.

As células têm várias formas de responderem a uma lesão do seu material genético, podendo ir desde a reparação do dano até apoptose ou a célula entrar em senescência. Quando estes mecanismos falham, pode ocorrer cancro. A proteína Rho GTPase está directamente envolvida na regulação da senescência e do ciclo celular de células tumorais transformadas por ras induzidas por agentes stressantes. As proteínas RhoA, Cdc42Hs e Rac1 ( todas substracto para a toxina A do Clostridium difficille ) pertencem à família das proteínas sinalizadoras Rho GTPase que actuam como interruptores moleculares, estando activa quando ligado a GTP e inactiva quando ligada a GDP.

As toxinas A e B são os principais factores virulentos do C.difficile, sendo os agentes causais da colite pseudomembranosa associada a antibioticoterapia. Os resultados citotóxicos das toxinas, advêm da capacidade de induzirem a desagregação dos microfilamentos do citoesqueleto.

A toxina B actua na proteína RhoA GTPase, de baixa massa molecular. A toxina B cataliza a incorporação de até 1 mole de glicose por mole de proteína RhoA no aminoácido treonina, na posição 37. O UDP-glucose serve selectivamente de co-substracto para a reacção de monoglicosilação catalizada pela toxina B. A proteína RhoA glicosilada causa desagregação dos filamentos de actina, indicando uma actividade dominante negativa da RhoA glicosilada. A glicosilação da proteína Rho também leva à inibição da fosfolipase D.

Existem estudos demonstrando ausência de efeito enterotóxico in vivo por parte da toxina B. No entanto, a toxina B provoca, de forma dose-dependente, alterações electrofisiológicas e morfológicas na mucosa colónica humana, in vitro. A toxina B também estimula a síntese, de mediadores inflamatórios potentes, por monócitos e macrófagos.

Já os efeitos provocados pela toxina A são evidentes, caracterizando-se por intensa secreção de fluídos e grande acúmulo de células inflamatórias ( macrófagos, mastócitos, linfócitos e neutrófilos ) com libertação dos seus mediadores, nomeadamente prostaglandinas, leucotrienos, factor de agregação plaquetária, óxido nítrico e citocinas.

Foram identificadas cepas de C.difficile presentes em humanos, bem como em animais, não produtoras de toxinas e incapazes de causar diarreia. Até há alguns anos atrás, C.difficile era difícil de distinguir de outras bactérias, como C.sporogens. Com a introdução de um meio de cultura contendo ciclosserina e cefoxitina e frutose em agar esta distinção foi facilitada. Actualmente existem meios automáticos capazes de identificar a C.difficile.

Contraimunoelectroforese e aglutinação em latex são meios capazes de identificar as toxinas do C.difficile.

A resposta do hospedeiro ao C.difficile varia de portador assintomático até à colite pseudomembranosa, pensando-se que esta gama de respostas do hospedeiro ao organismo patogénico seja relacionada com modificações nos receptores das toxinas ou das defesas imunológicas.

Colite pseudomembranosa tem sido correlacionada, em 98-100 % dos casos, com C.difficile toxicogénica, enquanto que diarreia associada a antibioticoterapia se relaciona em 50-80% dos casos.

As toxinas de C.difficile, particularmente a toxina B, alteram a arquitectura celular e marginalização nuclear, mudanças estas geralmente irreversíveis e que inibem a divisão celular tendo, desta forma, actividade antiproliferativa. Para além destas alterações morfológicas, a toxina B causa perda de potássio e cálcio intracelulares e diminuição da síntese do RNA e DNA, com consequente diminuição da síntese proteica.

A toxina B não apresenta efeitos enterotóxicos, ou seja, não provoca secreção de fluídos, lesão morfológica nem infiltrado inflamatório na mucosa intestinal in vivo. A toxina A é cerca de 1000 vezes mais potente que a toxina B nos seus efeitos citotóxicos.

Ambas as toxinas são capazes de estimular macrófagos, in vitro, a libertar potentes mediadores inflamatórios como os leucotrienos e citoquinas.

Ambas as toxinas do C.difficile, toxina A e toxina B, são potentes estimuladores da libertação de α-TNF, IL-1 e IL-6 por monócitos humanos.

A toxina A é capaz de produzir intensa secreção de fluídos, aumento da permeabilidade intestinal e potente reacção inflamatória aguda na mucosa intestinal, caracterizada por necrose epitelial, edema hemorrágico, ulceração e activação de macrófagos e mastócitos com subsequente mobilização de neutrófilos para o foco inflamatório.

Os mecanismos envolvidos na resposta inflamatória da toxina A são complexos e envolvem a libertação de potentes mediadores inflamatórios, como a PgE2, leucotrienos B4 e C4, factor activador de plaquetas, IL-1, IL-8, histamina e óxido nítrico por células residentes da lâmina própria intestinal.

Também os mastócitos têm sido implicados nas acções biológicas da toxina A.

A capacidade que a C.difficile tem, de aderir à superfície das células, é primordial para dar início à primeira etapa de colonização do intestino, sendo que os níveis de adesão são mais altos em cepas mais virulentas.

Verificou-se que o C.difficile pode aderir em vários tipos celulares, essa adesão é dependente de factores ambientais e mediada por vários componentes proteicos.

O locus de patogenecidade do C.difficile é formado por 5 genes: tcdA, tcdB, tcdC, tcdD e tcdE.

As toxinas A e B são toxinas clostridiais de alto peso molecular, de cadeia única, com 3 domínios funcionais: domínio catalítico C-terminal, domínio de ligação N-terminal e domínio de translocação putativa. O nível de esporulação é inversamente proporcional ao nível de produção de toxinas.

As toxinas A e B causam o rompimento do citoesqueleto de actina e das tight juntions, resultando na diminuição da resistência transepitelial, acúmulo de fluídos e destruição do epitélio intestinal.

As toxinas A e B perturbam o citoesqueleto de actina das células epiteliais intestinais por meio de UDP-glucose dependente, sendo capazes de monoglicosilar a proteína Rho e ras que pertencem à família GTPase de baixo peso molecular. O efeito desta glicosilação relaciona-se com a transdução do sinal.

Além da produção das toxinas A e B, C.difficile pode produzir uma terceira toxina, toxina binária ( ADP-ribosiltransferase específica para actina ) codificada pelos genes tcdA e tcdB.

O locus tcdC do PaLoc ( locus de patogenecidade ) é o regulador negativo, e uma mutação nesse locus origina uma superexpressão de tcdA e tcdB, produção de toxina binária, maior esporulação em menor tempo, maior capacidade de adesão e resistência a novos antimicrobianos, principalmente quinolonas.

As proteínas Rho GTPase actuam na regulação de vários processos celulares essenciais, incluindo a transcripção génica, adesão celular, migração celular e progressão do ciclo celular.

É importante destacar o papel marcante das Rho GTPases nos processos celulares envolvidos com a organização do citoesqueleto, como sejam a regulação da polaridade celular, transcripção génica, progressão da fase G1 do ciclo celular, dinâmica dos microtúbulos, vias de transporte de vesículas e uma variedade de actividades enzimáticas. As proteínas Rho GTPase também podem alterar a expressão de genes codificantes de proteínas envolvidas na proteólise da matriz extracelular.

Dos membros da família Rho GTPase, a activação da proteína Cdc42Hs estimula a polimerização da actina para filopodia ( extensões finas e longas ) enquanto Rac induz a activação de polimerização da actina para formar lamelipodios ( projecções ). A subfamília Rho também regula a agregação dos filamentos de actina em fibras de stress e a formação de complexos de adesão focal.

As Rho GTPases agem como interruptores ( switches ) moleculares que alternam entre estado inactivo, ligado a GDP, e activo, ligado a GTP.

No estado inactivo, as Rho GTPases interactuam com as cascatas de activação específicas, para desempenharem suas funções celulares. Este processo é regulado pelos factores de troca de guanina ( GEF's - guanine exchange factor ) e proteínas activadoras de GTPases ( GAP's ). GEF's catalizam a conversão do estado ligado a GDP para um estado ligado a GTP e as GAP's aceleram a taxa intrínseca de hidrólise de GTP para GDP.

Também participam deste processo os inibidores de dissociação de GAP ( GAI's ) que regulam a activação das Rho GTPases por meio do processo de captura do ligante Rho em ambos os estados ligado a GTP ou a GDP, e permitem o transporte dessas substâncias entre o citosol e a membrana.

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Os probióticos podem oferecer uma terapêutica adjuvante promissora à terapêutica com vancomicina e metronadizol nas infecções por C.difficile uma vez que várias estirpes produzem proteases que degradam as toxinas da C.difficile ou aumentam a resposta imune às toxinas A e B.

Verificou-se que tratamento combinado com probióticos, aos antibióticos, normalmente usados para combate à C.difficile resulta numa resposta superior e redução significativa do risco de infecção por C.difficile.

Os probióticos usados são as bactérias produtoras de ácido láctico, nomeadamente L.caseii, L.bulgaricus e Streptococcus thermophilus, e apresentam-se muito eficazes.

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As proteínas p21, p27 e p57 são inbidores do ciclo celular, que bloqueiam a proliferação das stem cells em vários tipos de tecidos. Rho GTPase regula negativamente os níveis dos inibidores do ciclo celular p21cip1 e p27KIP1.

P21, p27 e p57 bloqueiam a proliferação das stem cells

Rho GTPase regula negativamente os inibidores p21 e p27

donde

Rho GTPase bloqueando p21 e p27 aumentam a proliferação das stem cells

O controlo do ciclo celular é feito na passagem da fase G1 para S

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As Rho GTPases, através de inúmeras outras proteínas alvo, participam de vias de sinalização com notável relevância na biologia do citoesqueleto e microtúbulos. Essas proteínas desempenham papel de destaque no cancro, pois contribuem para o ciclo celular, morfogénese e migração.

A proteína Rho é necessária para impedir a expressão da p21.

As Rho GTPases têm sido relatadas por contribuirem com a iniciação e progressão do cancro, incluindo um potencial ilimitado de proliferação, sobrevivência, apoptose, invasão dos tecidos e estabelecimento de metástases.

A proteína Rho é necessária, no final do ciclo celular, para a formação da actina e miosina, que separam as células filhas.

O membro da família Rho, Cdc42Hs, pode contribuir para a formação e progressão do tumor activando a proteína Rac.

O aumento de expressão de Rho A é relacionado com um aumento em sua actividade, contribuindo para um mau prognóstico e recorrências em alguns carcinomas, como o epidermóide do esófago. Estes dados sugerem que Rho A tem papel importante na progressão da malignização de vários tumores.

Rho B parece ter funções de supressor do tumor e encontra-se diminuída a sua expressão em carcinomas pouco diferenciados e altamente invasivo.

Radiações UV, citoquinas ou factores de crescimento induzem a expressão da Rho B, ao contrário do que sucede com Rho A e Rho C.

As proteínas Rho A GTPase estão envolvidas na organização da rede de microfilamentos, interacção célula-célula e transformação maligna.

A toxina A do C.difficile inactiva as Rho GTPase através da glicosilação de um resíduo treonina específico e impede interacções destas GTPases com moléculas efectoras. A toxina A da C.difficile promove alterações na forma das células e grande desorganização do citoesqueleto de actina.

As Rho GTPases contribuem para a iniciação e progressão do cancro incluindo a aquisição de potencial ilimitado de proliferação, sobrevivência e evasão de apoptose, invasão de tecidos e o estabelecimento de metástases.