Sinalizador celular – Ubiquitina

Sinalizador celular – Ubiquitina

Ubiquitina

A ubiquitina é uma proteína fundamental na regulação de processos biológicos, assinalando algum processo que deve acontecer ao substracto com o qual está ligado, como por exemplo as proteínas alvo serem degradadas pelo proteossoma.

O proteossoma é uma proteína com função de degradação de outros substractos, como um triturador que as células possuem.

http://youtu.be/93in7Bxo5W0

Cerca de 600 genes codificam ubiquitina-ligases no genoma humano. Foi descrita uma ubiquitina-ligase que controla a dinâmica mitocondrial, denominada MULAN ( Mitochondrial Ubiquitin Ligase Activation of NF-kB ).

O gene BRAC1, ligado ao cancro da mama e outros cancros, como pâncreas e próstata, quando mutado pode eliminar a função ubiquitina-ligase.

cDNA ou DNA complementar é o DNA sintetizado por uma molécula de RNA mensageiro numa reacção catalizada pela transcriptase reversa que quando inserido numa célula, este cDNA pode levar ao aumento dos níveis da proteína codificada.

RNAi ou RNA de interferência é uma técnica que permite inibir a acção dum gene escolhido, por exemplo o RNAi pode suprimir genes que causam tumores diminuido o desenvolvimento do cancro.

http://www.youtube.com/watch?v=93in7Bxo5W0

A via da ubiquitinação tem 3 etapas, sendo que cada uma envolve uma enzima: E1 ( enzima activadora da ubiquitina ), E2 ( enzima conjugadora ) e E3 ( ubiquitina-ligase ).

Via ubiquitina-proteossoma

A via da ubiquitina-proteossoma é uma via proteolítica que, ao contrário das demais, consome ATP e inicia-se com a ubiquitinação da proteína alvo.

Os alvos da ubiquitina são:

• receptores celulares da membrana celular
• moduladores de crescimento e supressores de tumor
• activadores e inibidores de transcripção
• reguladores de ciclo celular
• proteínas mutantes ou danificadas, sendo estas especialmente frequentes chegando a 30% das proteínas recém-sintetizadas

http://youtu.be/4DMqnfrzpKg

As chaperonas desempenham um papel activo no reconhecimento das proteínas com síntese defeituosa. As chaperonas são proteínas que auxiliam outras proteínas a se dobrarem, necessitando várias chaperonas de ATP, e algumas proteínas para atingirem a estrutura quaternária são dependentes das chaperonas. O reconhecimento da má dobragem das proteínas, ainda que não totalmente ilucidado, sabe-se que utiliza os grupos hidrofóbicos para esse reconhecimento.

As chaperonas interferem activamente na ubiquitinação, interagindo com as enzimas E2, pensando-se que as chaperonas são responsáveis pelo reconhecimento e marcação da proteína pela ubiquitina.

http://www.youtube.com/watch?v=SUCgAxI8rhg

Outro sistema importante para o reconhecimento de proteínas mal formadas é o ERAD ( Endoplasmic Reticulum Associated protein Degradation ) que é o responsável pela degradação das proteínas sintetizadas no retículo endoplasmático e que também utiliza as chaperonas como auxiliares. Estas proteínas após a ubiquitinação vão para o citoplasma e são degradadas pelos proteossomas.

A via ubiquitina-proteossoma envolve várias etapas, nomeadamente:

1. Activação: a enzima E1 activa a ubiquitina cujo resíduo C-terminal se liga covalentemente a um resíduo sulfidril-cisteína da E1 na presença de Mg²+ e com consumo de uma molécula de ATP que se degrada em AMP e Pi ( pirofosfato )
2. Transferência: a ubiquitina é transferida para a enzima E2 e liberta-se a enzima E1
3. Reconhecimento: a enzima E3 reconhece e liga-se à proteína alvo formando um complexo não covalente
4. Ubiquitinação: o complexo E2-ubiquitina liga-se a E3 por forma à ubiquitina ser transferida de E2 para o grupo amina dum resíduo lisina da proteína alvo
5. Libertação: a enzima E3 solta-se, libertando E2 e a proteína ubiquitinada
6. Poli-ubiquitinação: as etapas 3, 4 e 5 repetem-se formando uma ou mais cadeias de ubiquitina, cadeias estas que se ligam aos resíduos de lisina da última cadeia
7. Desubiquitinação: a cadeia de ubiquitina é reconhecida pelo proteossoma, sendo a proteína desubiquitinizada por enzimas próprias e a proteína desdobrada com consumo de ATP e hidrolisada, dando origem a pequenos peptídeos de 7-9 aminoácidos.

Apenas proteínas que sofreram poli-ubiquitinação são capazes de acessar ao núcleo proteolítico do proteossoma.

A enzima E3 ( ligase ) é a responsável pela especificidade da ubiquitinação capaz de fazer o reconhecimento e etiquetagem de vários substractos.

A ubiquitinação é um processo reversível em que as desubiquitinases ( enzimas hidrolíticas ) competem com o proteossoma, removendo as ubiquitinas terminais da cadeia ou mesmo a cadeia inteira.

Ao contrário da ubiquitinação, que é um processo reversível, a proteólise não o é, uma vez que as proteínas são degradadas a oligopeptídeos. Esta assimetria reaccional permite impôr uma direcção ao sistema, permitindo por exemplo o ciclo celular.

Via da ubiquitina-proteossoma ( UPP )

A ubiquitina é uma proteína das células eucarióticas, formada por 76 aminoácidos, e que tem uma função importante na regulação da síntese proteica, marcando as proteínas mal dobradas para estas serem degradadas pelos proteossomas.

A ubiquitina, para além do processo proteolítico não lisossomal, das proteínas mal dobradas, também tem acção não proteolítica no transporte pela membrana, na estrutura e transcripção da cromatina, na reparação do DNA e noutras vias sinalizadoras.

http://www.youtube.com/watch?v=4DMqnfrzpKg

As proteínas encontram-se num estado dinâmico, sendo continuamente sintetizadas e degradadas, sendo o controlo dessa actividade e degradação vital para a célula. As vias proteolíticas são os meios pelos quais as células se libertam das proteínas indesejadas.

As principais vias proteolíticas são a via lisossomal, via dependente do cálcio e via da ubiquitina-proteossoma, sendo que esta última difere das anteriores por ser selectiva e consumir ATP.

A ubiquitina é uma molécula que tanto se encontra no núcleo como no citoplasma; apresenta grande tolerância ao pH e à temperatura, apenas variando entre a conformação dobrada e não dobrada, justificada esta conformação por ser determinada por ligações de hidrogéneo.

A estrutura secundária da ubiquitina é formada por 3 segmentos em α-hélice e 5 em folhas β, tendo um peso molecular de 8564 Daltons

Estrutura tridimensional da ubiquitina

Ubiquitinas podem formar cadeias através da ligação de várias ubiquitinas, ocorrendo a ligação entre a glicina terminal e a lisina, podendo esta ligação ser feita várias vezes, originando di-, tri- ou tetra-ubiquitinas. A síntese da ubiquitina realiza-se nos ribossomas.

Tanto a ubiquitina como sua via proteolítica participam de diversos processos celulares. A ubiquitina liga-se à ciclina, na fase G1 da mitose, ajudando a regular o ciclo celular; a ubiquitina é responsável por estimular a diferenciação entre os tipos de linfócitos B e T, e seus fragmentos funcionam extracelularmente como imunossupressores. A ubiquitina tem acção na biogénese dos ribossomas, modulação de receptores celulares, expressão génica, reparação de DNA, resposta ao stress, morfogénese neuronal, memória de longo prazo, ritmos circadianos e em diversas doenças como Alzheimer, Down, cancro, HIV e Ébola.

A ubiquitinação realiza-se com a ajuda de 3 tipos de enzimas: E1, E2 e E3. Só é conhecida uma E1 ( enzima activadora da ubiquitina ) que transfere ubiquitina a todas as E2, sendo que a E2 já tem alguma especificidade ao substracto, embora sejam as E3 as que apresentam grande especificidade. Enquanto há apenas uma E1, existem 5-12 proteínas E2. As E3, de 250 kDa, são as responsáveis pelo reconhecimento da proteína e transferência da ubiquitina de E2 para E3. Actualmente aceita-se que a poli-ubiquitinação é mediada pela enzima E4, que coopera com as E3 para estabelecer a cadeia de poli-ubiquitina.

Todas as proteinas intracelulares e muitas extracelulares estão constantemente a ser reconstituídas, isto é são hidrolizadas nos seus aminoácidos constituintes e novamente sintetizadas. Esta situação de construção-destruição das proteínas é importante para funções homeostáticas. A degradação das proteínas não é feita para todas à mesma velocidade, indo o tempo de degradação proteica de fracções de segundo até semanas ( como a actina e miosina ) ou meses ( hemoglobina ). As células possuem múltiplos sistemas proteolíticos usados na degradação das proteínas e complexos mecanismos reguladores que assegurem os processos proteolíticos contínuos são altamente selectivos.

A maioria das proteínas intracelulares são degradadas pela via ubiquitina-proteossoma. Algumas proteínas de superfície e as proteínas extracelulares são tomadas por endocitose e degradadas nos lisossomas que contêm várias proteases e hidrolases. Algumas proteínas citosólicas são degradadas nos lisossomas após sofrerem autofagia e sendo assim englobadas em vacúolos que se fundem com lisossomas. Este processo é acelerado, nas células, pela falta de insulina ou aminoácidos essenciais e, no fígado, pelo glucagon.

Outra família importante de proteases citosólicas são as caspases que fazem a clivagem nos resíduos do ácido aspártico. As caspases, proteases de cisteina, têm uma função crítica na destruição dos componentes celulares no processo de apoptose.

A via ubiquitina-proteossoma liga a ubiquitina às proteínas marcadas para degradação. Este processo de marcação leva as proteínas a serem reconhecidas pela proteossoma que degrada as proteínas ubiquitinadas a pequenos polipeptídeos.

A via ubiquitina-proteossoma utiliza 3 enzimas denominadas E1, E2 e E3. Enquanto E1 e E2 preparam a ubiquitina para a conjugação, a E3 ( ligase ) reconhece o substracto proteico específico e cataliza a transferência da ubiquitina activada para esse substracto proteico.

Factores de transcripção podem ser regulados por alterações na sua localização intracelular. Um exemplo é o que se passa com NF-kB activador transcripcional pro-inflamatório mantido fora do núcleo pela sua interacção com IkB. A fosforilação desta molécula IkB desencadeia a sua degradação, o que leva a que seja reconhecido pela E3 β-transducina repeat containing protein ( β-TRCP ). A IkB é ubiquitinada e degradada rapidamente, permitindo que NF-kB fique livre e se dirija para o núcleo. Este passo é de fundamental importância na aceleração do processo inflamatório.

A via da ubiquitina-proteossoma elimina selectivamente as proteínas defeituosas, seja esse defeito por mutação, erro de síntese ou lesão por radicais de oxigéneo ou desnaturação pelas altas temperaturas.

A via proteolítica extralisossomal dependente de ATP, ubiquitina-proteossoma, é extremamente importante em diversos mecanismos reguladores celulares como transdução de sinal, controlo de ciclo celular, endocitose mediada por receptores, transcripção genética, controlo de qualidade de síntese proteica, fornecimento de aminoácidos em situação de carência nutricional ou condições patológicas, apresentação de antigenes e apoptose.

O sistema proteolítico lisossomal foi o primeiro sistema proteolítico intracelular identificado, mas foram descobertos outros sistemas intracelulares extralisossomais proteolíticos

Proteólise lisossomal

A via da ubiquitina-proteossoma é uma via proteolítica, de fundamental importância para a viabilidade celular, dependente do ATP. A ubiquitina é formada por uma protease de 1000-1500 kDa, formada por subunidades de 34-110 kDa. É formada por um núcleo catalítico cilindríco, denominado proteosoma 20 S e uma porção 19 S onde se localizam as ATPases responsáveis pelo desenovelamento das proteínas a serem degradadas pelas actividades proteolíticas da subunidade 20 S.

A ubiquitinação proteica é uma modificação pós-transducional consistindo esta da adição de uma ou mais moléculas de ubiquitina a proteínas específicas que alteram a função, localização celular ou a direccionam para a degradação no proteosoma.

Proteosoma

Nas células eucarióticas, a principal via de degradação proteica de semi-vida curta é dependente do ATP e da ubiquitina e não uma via lisossómica. Na via ubiquitina-proteossoma são degradadas proteínas reguladoras de certas funções que por isso existem em curtos períodos de tempo, bem como proteínas danificadas ou com erros na sua síntese, que são marcadas para degradação por meio da ligase de cadeia poli-ubiquitina. Estas proteínas assim marcadas são reconhecidas e degradadas pelo proteosoma 20 S após terem sido desenoveladas no proteossoma 19 S. Esta via ubiquitina-proteossoma funciona no citoplasma e núcleo das células. Proteínas associadas ao retículo endoplasmático também são degradadas pela via ubiquitina-proteossoma após o seu retrotransporte para o citoplasma.

A falta de apertado controlo do ciclo de divisão celular está implicado no desenvolvimento tumoral. A via ubiquitina-proteossoma joga uma função fundamental pelo menos em 3 períodos do ciclo de divisão celular. Na transição G1/S, a iniciação da replicação do DNA é desencadeada pela degradação dum inibidor duma cinase dependente da ciclina. Quando este inibidor é fosforilado, uma E3 o reconhece como substracto e dá-se a ubiquitinação e subsequente degradação. Na mitose, a securina ( endoprotease envolvida na separação dos cromossomas ) é ubiquitinada e degradada pela proteossoma. Na fase final da mitose, as ciclinas e factores que controlam a desmontagem do fuso mitótico sofrem degradação pela via ubiquitina-proteossoma.

Esta via ubiquitina-proteossoma também produz peptídeos antigénicos a partir de proteínas de bactérias ou virus. Os peptídeos apresentados às células citotóxicas T nas moléculas do complexo major de histocompatibilidade da classe I resultam de proteólise, limitada dos antigéneos, mediada pelos proteossomas. O γ-interferão estimula este processo induzindo a troca de subunidades catalíticas do proteosoma 20 S. O sistema dependente da via ubiquitina-proteossoma degrada tanto as proteínas celulares ( self ) como as estranhas ( non-self ).

Os peptídeos são apresentados às células citotóxicas T mas apenas os derivados das proteínas estranhas desencadeiam resposta das células T.