Relação causal entre Mycobacterium avium paratuberculosis e Doença de Crohn

Relação causal entre Mycobacterium avium paratuberculosis e Doença de Crohn

Mycobacterium avium paratuberculosis ( MAP ) é um pequeno bacilo Gram positivo, intracelular, patogéneo obrigatório, ácido resistente que pertence à família das Mycobacteriacea. Tem um crescimento muito lento e, em microscopia, costuma apresentar-se em pequenos clusters. Apresenta uma parede celular espessa, composta principalmente por lípidos, que determinam a sua resistência à descoloração pelo ácido, hidrofobicidade e resistência a processos químicos, como a cloronização das águas, e a processos físicos, como a pasteurização ou os processos utilizados na produção do queijo.

A Doença de Crohn é uma doença inflamatória granulomatosa crónica da mucosa intestinal e que pode atingir todo o tracto gastrointestinal.

A associação do MAP com a doença de Crohn parece ser específica, mas o seu papel na etiologia da doença de Crohn permanece incerto.

O MAP é um robusto, e fenotipicamente versátil, patogéneo causador de doença inflamatória intestinal. O MAP aparece no leite da vaca, mesmo após pasteurização. Também a água corrente canalizada é uma fonte de contaminação por MAP. Devido à dificuldade em identificar o MAP, este tem sido difícil de lhe ser atribuída responsabilidade na etiologia da doença de Crohn, mas parece evidente. MAP cora negativamente por Ziehl-Neelsen, e é altamente resistente aos químicos e lise enzimática. As melhores amostras para detecção de MAP em cultura são de amostras da mucosa intestinal humana, que asseguram acesso ao DNA do MAP e maximizam a detecção destes patogéneos de muito rara quantidade.

A taxa de detecção do MAP, em doentes com doença de Crohn, é altamente significativa, e implica este patogéneo entérico crónico ( MAP ) na etiologia da doença de Crohn. No entanto, a associação entre MAP e doença de Crohn é mal entendida. Técnicas de PCR IS 900 específicas, em conjunto com processos optimizados para recolha de amostras por meios cirúrgicos, levaram à demonstração inicial de que o MAP pode ser detectado em 65%-95% dos doentes com doença de Crohn.

Dado ter sido demonstrado que, mesmo no leite pasteurizado, o MAP pode aparecer, há um risco acrescido das pessoas serem infectadas por esta bactéria.

As amostras da mucosa intestinal devem ser obtidas da zona inflamada do intestino e não do fundo das úlceras, pois esta zona ulcerosa pode ser fortemente fibrótica. As amostras não podem ser congeladas em nenhum momento do procedimento.

IS 900 é definido como sendo um elemento multicópia 1451 bp inserido em 14-18 loci conservados no genoma do MAP, cuja completa sequência de DNA compartilha 99.6%-100% de homologia com a sequência IS 900 depositada no GenBank. Até à data, a IS 900 é única para o MAP.

MAP é extraordinariamente difícil de detectar directamente, e a reprodutibilidade por técnicas de PCR, aplicadas directamente ao DNA extraído de tecidos e outras amostras humanas, auxilia muito nesta detecção.

O uso de amostras sub-óptimas pode resultar em falsos negativos. As amostras devem ser processadas em fresco, e nunca quando congeladas. É necessário assegurar o acesso ao DNA do MAP através de procedimentos de rotura mecânica celular.

A detecção do MAP em doentes com doença de Crohn, e utilizando os procedimentos óptimos incluindo a rotura mecânica, é de 92%. É necessária precaução para evitar falsos positivos dados por organismos com crescimento mais rápido, e que são outras micobactérias. A principal propriedade que distingue o MAP de todos os outros microorganismos potenciais causadores de doença de Crohn, é a capacidade específica do MAP em causar inflamação crónica do intestino, numa ampla gama de tipos histopatológicos, em muitas espécies de animais, incluindo primatas. A sua presença na quase totalidade dos doentes com inflamação crónica intestinal do tipo doença de Crohn sugere causalidade.

Drogas como a rifabutina ou claritromicina, que são mais eficazes contra o MAP do que os tuberculostáticos normais, podem ser seguidos de remissão e cura da inflamação intestinal na doença de Crohn.

MAP, presente no leite, pode sobreviver à pasteurização. É termorresistente e é capaz de se autossequestrar dentro dos leucócitos, facto este que contribui para a sua persistência no leite. O MAP também sobrevive à cloronização da água. O MAP é um microorganismo de lento crescimento e difícil cultura.

O MAP não é muito susceptível aos tuberculostáticos habituais. É, no entanto, susceptível a antibióticos como a rifabutina e claritromicina, mas estes agentes ainda não estão bem definidos na sua capacidade de erradicarem o MAP.

Mycobacterium avium paratuberculosis é um microorganismo com provada capacidade para iniciar e manter infecção sistémica e inflamação crónica do intestino. Neste sentido, está em estado avançado, estando já em fase 2/3 aprovada pela FDA, uma mistura de rifabutina, claritromicina e clofazimina, como potencial terapêutica da doença de Crohn, na assumpção de esta doença ser provocada pelo MAP.

MAP tem sido encontrado no intestino, em número maior, em doentes com doença de Crohn do que em doentes com colite ulcerosa e em pessoas saudáveis.

O MAP encontrado em doentes com doença de Crohn, é do subtipo bovino, significando ser de origem bovina, o que apoia a ideia de que é passado ao Homem através de produtos de origem bovina, e nomeadamente do leite. Remissões prolongadas têm sido conseguidas tratando os doentes com drogas anti-micobacterianas eficazes contra o MAP. Num estudo, foram observadas 80% de remissões acentuadas em doentes com doença de Crohn usando este tipo de tratamento.

Foi demonstrado que o MAP liberta uma molécula complexa, contendo um açúcar, a manose. Esta molécula impede que os macrófagos matem a E.coli. Verifica-se que os doentes com doença de Crohn apresentam um número aumentado de E.coli e fraca capacidade de lutarem com as bactérias intestinais. O efeito supressivo do MAP, descrito atrás, sugere que é um mecanismo para enfraquecimento das defesas corporais contra as bactérias. Verificou-se também  que  o  MAP  é  um  desencadeador  da  produção  de uma  proteína  circulante  anticorpo ( ASCA ) encontrada em cerca de dois terços dos doentes com doença de Crohn, sugerindo isto uma prévia infecção pelo MAP.

O MAP pode libertar a manose, um açúcar que actua como um imunoinibidor, que permite o sobrecrescimento de outras bactérias, como a E.coli.

Um estudo, realizado nos Estados Unidos, encontrou MAP viável em cerca de 3% do leite pasteurizado à venda. No entanto, e advogando ideia contrária à da relação do MAP com a etiologia da doença de Crohn, Barkema diz que embora possa sobreviver à pasteurização, em número reduzido, isso não explica os altos números de doentes com doença de Crohn que há nos países desenvolvidos.

Foi, no entanto, afirmado que qualquer bactéria presente ( MAP ), tanto viável como morta, pode contribuir para a doença de Crohn, pelo que mesmo as MAP mortas, no processo de pasteurização, podem ter papel na etiologia da doença de Crohn, pois as paredes bacterianas e restos de bactérias permanecem no leite; estes fragmentos estarão presentes através do tracto gastrointestinal, bem como ao longo do organismo todo, devido à ligação através da parede intestinal com a circulação sanguínea, e dessa forma, processos de resposta imunitária seriam desencadeados em várias zonas do organismo, como por exemplo, fragmentos celulares do MAP circulariam até às articulações das mãos, através da corrente sanguínea, e uma resposta imunitária local originaria as artrites.

Também foi hipotetizada a transmissão maternofetal do MAP.

A inflamação e lesão tecidular é mediada por uma resposta imunológica celular. No entanto, uma resposta imunológica celular dirigida ao MAP ainda não foi documentada na doença de Crohn, apesar de um número maior de respostas serológicas aos antigenes do MAP serem verificadas.

Um ponto contrário à teoria do MAP como agente causador de doença de Crohn é, estes doentes, responderem a terapêutica imunossupressora e infecções imunossupressoras adquiridas diminuem a actividade da doença de Crohn à medida que as células T CD4+ diminuem em número. Pelo contrário, Mycobacterium tuberculosis massivamente prolifera com anti-α-TNF, ou tratamento com corticóides.

O receptor intracelular chamado NOD2/CARD15 ( nucleotide-binding oligomerization domain containing 2 / caspase recruitment domain-containing protein 15 ) é um receptor intracelular do muramil dipeptídeo ( MDP ), o mais pequeno componente imunologicamente activo do peptídeoglicano bacteriano. A ligação do MDP pelo NOD2/CARD15 activa a citoquina NF-kB e esta via pode contribuir para a clearance de infecções bacterianas intracelulares e secreções de α-defensinas pelas células de Paneth, que expressam constitutivamente NOD2/CARD15. Os 3 mais comuns polimorfismos deste gene NOD2/CARD15 estão encontrados em 25%-35% dos doentes com doença de Crohn caucasianos, e leva a uma activação deficiente de NF-kB pelo MDP.

Mutações NOD2/CARD15 em doentes com doença de Crohn estão associadas com diminuição da expressão das α-defensinas da mucosa, sendo uma explicação da ligação do NOD2/CARD15 à doença de Crohn o facto da função defeituosa deste gene resultar em ineficaz clearance da infecção intracelular pelo MAP e uma diminuição da secreção das α-defensinas luminais que permite um aumento da aderência à mucosa e invasão epitelial dos organismos ingeridos.

Eliminação deficitária das MAP intracelulares por células de imunidade inata, incluindo macrófagos, pode explicar as aparentes respostas terapêuticas paradoxais dos doentes com doença de Crohn à estimulação CSF-GM.

A hipótese de ligação MAP à doença de Crohn não é suportada pelos factos de que o MAP é mais frequente na doença colónica do que na ileal, e é mais frequente nos casos estenosantes.

A associação do MAP com a doença de Crohn parece ser específica, embora o seu papel na etiologia da doença de Crohn ainda não seja completamente defenida.

A MAP está presente no leite, nas fezes e na carne dos animais infectados, e não é morta pelas técnicas normais do processamento dos alimentos como pasteurização e cozinhamento. A MAP também se encontra nas fontes de água canalizada, e não é afectada pela cloronização normalmente realizada.

Em 1998 foi publicado no British Medical Journal um caso provado de doença de Crohn causado pelo MAP num doente humano. O doente desenvolveu uma infecção a MAP nos nódulos linfáticos do pescoço seguindo-se, após um período de incubação de 5 anos, por uma doença inflamatória intestinal indistinguível da doença de Crohn.

MAP é um patogénio obrigatório, i.e. não se pode multiplicar fora das células animais. Causa doença numa ampla variedade de animais, incluindo o Homem. Nos animais, o local mais frequentemente usado pelo MAP para se multiplicar é o tracto gastrointestinal, onde tende a causar doença inflamatória intestinal. O MAP ocorre em 2 formas: forma bacilar e forma esferoplástica. Muitas bactérias MAP, na forma bacilar, são necessárias para causar a doença clínica; já, pelo contrário, apenas alguns MAP em forma esferoplástica são suficientes para desencadearem a doença. Estes diferentes comportamentos das 2 formas da bactéria é um resultado da reacção imunológica do hospedeiro infectado.

Importante dado a favor da relação causal do MAP na doença de Crohn, é o facto do MAP estar presente nos tecidos, cronicamente inflamados, intestinais, enquanto que é rara a presença de MAP em pessoas com intestino não inflamado normal.

O fenótipo do MAP na doença de Crohn não tem a clássica parede celular rica em ácido micólico Ziehl-Neelsen positiva, sendo, dessa forma, pouco ou nada afectada pelos medicamentos usados na tuberculose, nomeadamente isoniazida, etambutol ou pirazinamida.

A replicação do MAP é extremamente lenta, o que leva a que estes organismos tenham uma susceptibilidade aos medicamentos ainda mais reduzida a drogas como ciprofloxacina. A susceptibilidade do MAP é superior aos medicamentos, relacionados à estreptomicina, rifabutina e claritromicina. A sua acção, é ao nível da inibição da polimerização do RNA e da produção proteica microbiana ao nível do ribosoma, e nestas acções são potenciados pela clofazimina. Estes 3 fármacos concentram-se nos macrófagos, células onde os MAP tendem a acumular-se.

O uso de rifabutina, claritromicina e clofazimina, em doentes capazes de tolerar este tratamento por longo tempo, leva à remissão prolongada da doença de Crohn e cura da mucosa intestinal. A maioria dos doentes que não resolvem a doença de Crohn quando sujeitos a este tratamento, podem estar infectados por MAP resistente àqueles agentes farmacológicos. Recaídas, no entanto, podem ocorrer, o que pode ser devido ao MAP desenvolver resistências aos fármacos ou à capacidade de entrar em estado de dormência e, dessa forma, ser extremamente difícil a sua erradicação.

O tratamento anti-MAP pode causar efeitos indesejáveis. Para além dos efeitos laterais das drogas em si mesmas, completa cura da mucosa intestinal inflamada pode resultar numa cicatriz fibrosada, que pode requerer tratamento cirúrgico para resseção de zonas de obstrução. Superinfecção por MAP também pode ocorrer.

Doença clínica pode emergir em indivíduos com susceptibilidade adquirida ou herdada, e pode ser desencadeada por stress físico ou psicológico. Pesquizas recentes, de base molecular, identificaram mutações na região carboxiterminal do NOD2/CARD15, codificado no cromossoma 16, que afecta 15%-20% dos doentes com doença de Crohn. Este gene NOD2/CARD15 é o receptor para os lipopolissacarídeos bacterianos expressado nos macrófagos. Outras mutações, tais como as da nucleoproteína STAT1, que se liga ao γ-interferão, podem também afectar a susceptibilidade à doença microbacteriana.

Juntamente com uma mucosa exsudativa, a inflamação transmural crónica resulta em perturbação da resposta inflamatória à penetração na parede intestinal de resíduos de comida e bactérias presentes no lúmen. Isto explica porque a doença de Crohn pode melhorar com imunomodeladores ou pela redução do componente alérgico, com as alterações acompanhantes na flora entérica, por terapêutica e dieta. No entanto, sem a irradicação da causa primária da doença, estes procedimentos não levarão a uma resolução de longa duração.

Evidências apontam para uma etiologia infecciosa. Entre elas podem-se incluir:

• taxa de afectação, entre gémeos monozigóticos, de apenas 42%
• afectação de vários membros da mesma família, inclusivé os cônjuges
• afectação de indivíduos não casados que têm contactos próximos

Há contudo a ter em conta que a infecção não parece ser o único factor na etiologia da doença de Crohn.

Embora a flora comensal intestinal, como um todo, possa estar envolvida no desencadear da doença de Crohn, vários micro-organismos parecem desempenhar um papel importante na etiologia da doença, sendo o MAP um deles. Anticorpos anti-MAP séricos são detectados em doentes com doença de Crohn. Parece que o factor inicial do desencadear da doença de Crohn é um factor infeccioso, como o provam experiências onde ratos deficitários em IL-10, vivendo em ambientes estéreis, não desenvolveram colite espontânea, mas quando passam a viver em ambientes normais essas doenças surgem.

Os MAP, nos humanos, assumem a forma de esferoplastos residentes dentro dos macrófagos e células dendríticas. A produção de citoquinas pró-inflamatórias ( IL-1β, IL-12, α-TNF, γ-INF ) pode contribuir para gerar o processo inflamatório existente na doença de Crohn.

IL-10 é considerada uma citoquina que diminui a morte dos MAP, e a expressão do IL-10 é sugerido ser um determinante da virulência do MAP.

O MAP inibe a acidificação dos fagossomas e diminui a maturação do fagossoma nos macrófagos, sendo estes os mecanismos que o MAP possui para possibilitar a sobrevivência dentro dos macrófagos.

Os estudos demonstraram que os resultados, na identificação da presença de MAP, são superiores, se a técnica da PCR for utilizada em amostras de biópsia intestinal comparativamente com amostras sanguíneas.

O fenótipo microbiano tem influência no desencadear da doença. Assim, exposição a formas extracelulares dos MAP podem conferir alguma protecção natural; pelo contrário, exposição a formas que passaram por macrófagos do leite ou protistas ambientais, podem pôr maiores ameaças aos humanos, particularmente em indivíduos com susceptibilidade adquirida ou herdada.

Dois mecanismos patogénicos cooperativos são propostos para a doença de Crohn. Infecção intracelular, com o patogéneo primário amplamente distribuído através do intestino, causa uma desregulação imunológica e uma neuropatia entérica crónica específica com perda da integridade da mucosa; segmentos de doença inflamatória resulta da resposta neuroimune alterada à penetração na parede intestinal de patogéneos secundários provenientes do lúmen, e que incluem tanto microorganismos da flora comensal como patogéneos mais agressivos, como a E.coli.

O aumento da permeabilidade da parede intestinal possibilita, para além da penetração dos patogéneos já referida, a entrada de resíduos de comida na parede intestinal, contribuindo como um componente alérgico para a perturbação inflamatória.

Terapêutica anti-MAP, com rifabutina e claritromicina, pode tratar, e curar, a doença de Crohn, com inversão do título positivo anti-MAP em reacções negativas, tanto no soro como em amostras de biópsia da mucosa intestinal.

O tratamento contra MAP, em doentes com doença de Crohn, leva a uma taxa de remissão da doença de Crohn da ordem dos 50%-80% dos casos, pelo que a terapêutica anti-MAP deve ser considerada uma hipótese muito plausível para o tratamento da doença de Crohn.

Os níveis de α-TNF diminuem com a terapêutica anti-MAP. A terapêutica usada é uma associação tripla de antibióticos, sendo os comummemte utilizados a rifabutina, claritromicina, clofazimina e menos habitualmente etambutol, estreptomicina e azitromicina.

MAP pode infectar directamente as células endoteliais e adipócitos, e provocar-lhes uma proliferação causando obstrução focal dentro dos vasos já existentes ( incluindo formação de granuloma ), desenvolvimento de novos vasos ( neoangiogénese e linfangiogénese ) e a “creeping fat“ do mesentério, fenómeno este onde é observado um grande acúmulo de gordura no mesentério. Grande número dos MAP podem ser encontrados no mesentério ligados a segmentos intestinais afectados pela doença de Crohn. As paredes das fístulas podem resultar da neoangiogénese e linfangiogénese que ocorrem na parede intestinal, e assim são locais também de presença de grande número de MAP.

O MAP pode infectar células endoteliais de vasos sanguíneos ou linfáticos, bem como células adiposas do mesentério e os macrófagos. As células endoteliais infectadas, proliferam, levando à obstrução dos vasos já existentes, e proliferam e migram formando a base de novos vasos sanguíneos e linfáticos. Os granulomas, que são colecções de macrófagos modificados, na doença de Crohn são resultado de transformações das células endoteliais proliferativas em granulomas. É também descrito que a ulceração secundária, fístulas e fissuras, observadas na doença de Crohn, são consequência do processo primário da obstrução linfática.

A doença de Crohn cursa muitas vezes com a formação de fístulas. As paredes das fístulas são formadas de tecido de granulação, que é parte de como o organismo responde a feridas. Fisiologicamente, o tecido de granulação é angiogénico.

Para além das drogas já mencionadas ( rifabutina, claritromicina e clofazimina e outras ), também o metrotexato, 6-mercaptopurina, a porção ácido 5-aminossalicílico da sulfassalazina, ciclospurina A, rapamicina e tacrolimos podem inibir o crescimento do MAP in vitro. Como os doentes com doença de Crohn, geralmente, estão a fazer algum destes medicamentos, a quantidade de MAP, já de si reduzida, pode ser ainda mais reduzida e assim de muito difícil despiste.

Na doença de Crohn foram associados os pleomorfismos de vários genes, tendo sido o NOD2/CARD15 o primeiro a ser identificado, e que é um sensor intracelular das bactérias, mas também o ATG16L1 e o IRGM, que são genes envolvidos na autofagia, estão envolvidos.

NOD2/CARD15 activa a citoquina NF-kB, assinalando a via da ligação do componente muramildipeptídeo do peptídoglicano bacteriano ( MDP ).

A autofagia, com o envolvimento do ATG16L1 e IRGM, é um processo celular constitutivo importante, envolvido no turnover proteico e remoção de componentes subcelulares. O ATG16L1 é importante para a biologia das células de Paneth intestinais e a autofagia também é importante na resistência antibacteriana. A quebra da função do IRGM  leva  a  uma  marcada  sobrevivência   do bacilo  de  Koch  nos  macrófagos humanos ( será assim também com o MAP ? ).

NOD2/CARD15, IRGM e ATG16L1, são todos factores de risco para a doença de Crohn, mas não para a colite ulcerosa. Pelo contrário, os genes IL-23r e IL-12B são determinantes tanto para a doença de Crohn como para a colite ulcerosa, o que evidencia que estas 2 patologias compartilham algumas vias inflamatórias mas não outras.

Demonstrou-se que células T que reagem com várias bactérias estão presentes no intestino de doentes com doença de Crohn, mas no entanto a maioria dos doentes tem uma resposta dominante contra o MAP. Há um aumento das células CD4+, produtoras de interleuquinas inflamatórias, nas lesões presentes na doença de Crohn. Foi já demonstrada a presença de células T que respondem a bactérias comensais em doentes com doença activa. As células T intestinais de doentes com doença de Crohn respondem mais vigorosamente contra antigenes do MAP do que as dos doentes com colite ulcerosa. Há também uma frequência mais elevada de células T reactivas ao MAP quando comparadas com as células T que respondem às bactérias comensais no doente com doença de Crohn.

A acção da IL-17 é relevante no desenvolvimento da doença de Crohn. A produção de IL-17, induzida por IL-23, a partir das células T de memória e a produção de IL-17 promovida pela estimulação do NOD2/CARD15 através de um efeito sinérgico da IL-23 e IL-1 foram já demonstrados. O ligando para o NOD2/CARD15 é o MDP que está presente na parede celular bacteriana. Enquanto a maioria das bactérias produz N-acetil-MDP, as micobactérias produzem N-glicolil-MDP que é muito mais potente na indução das respostas inflamatórias NOD2/CARD15 dependentes. Estes dados, em combinação, apontam para haver relação entre NOD2/CARD15, micobactérias e a via IL-23/IL-17 da inflamação.

A relação entre MAP e doença de Crohn apresenta a mais plausível explicação como sendo: NOD2/CARD15 é um receptor intracelular do MDP, o mais pequeno componente imunologicamente activo do peptidoglicano bacteriano. A ligação do MDP ao NOD2/CARD15 activa a interleuquina NF-kB que pode contribuir para a eliminação da infecção bacteriana intracelular e secreção das α-defensinas pelas células de Paneth, que expressam constitutivamente NOD2/CARD15. Os 3 mais comuns polimorfismos do NOD2/CARD15 levam a uma deficiente activação do NF-kB pelo MDP e apresentam-se em 35% dos doentes com doença de Crohn. As mutações NOD2/CARD15 associam-se com diminuição da expressão das α-defensinas na mucosa. Assim, uma alteração do NOD2/CARD15 pode resultar em não eliminação das bactérias intracelulares pelo MDP e haver uma diminuição da secreção das α-defensinas na mucosa, permitindo uma maior adesão e invasão epitelial pelos microorganismos ingeridos.